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虫子739

铁虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】一个基因大概有2500bp左右。很长很长时间了,还没搞定,郁闷!请各位大� 已有4人参与

基因全长---一头雾水
植物基因,这个基因包括很多重复序列,大多为 G  I  V  D  R  A  K  D  T  V  G  M  G  P  N重复,也不知道这是什么片段,推测跟抗逆相关。根据GenBank和文献中的序列信息,设计引物,首先获得基因组DNA序列,1700多,和文献中的DNA序列差异较大。用同样的引物,mRNA序列一直没有获得。
现在做RACE,挑取3个克隆,其中两个重复,一个二次PCR产物。发现这二次PCR和一次的序列同源性几乎没有,除了引物序列。Why??
两个重复的克隆同源性还行,但这两个单克隆测序报告中指出不是单克隆,有套峰,明明是单克隆,为什么又这种情况?
谢谢!!
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虫子739

铁虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by 虫子739 at 2010-06-17 23:44:17:
基因全长---一头雾水
植物基因,这个基因包括很多重复序列,大多为 G  I  V  D  R  A  K  D  T  V  G  M  G  P  N重复,也不知道这是什么片段,推测跟抗逆相关。根据GenBank和文献中的序列信息,设计引物,首先获 ...

现在是序列信息有一些,但由于重复序列多,又不确定内含子边界,blast的时候,和不同片段比较,得到的信息不太确定
6楼2010-06-18 09:56:24
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zemin_fang

木虫 (正式写手)

★
1949stone(金币+1):谢谢交流 2010-06-18 09:12:59
虫子739(金币+1):我用的RNA为模板,为了拿到ORF区。 2010-06-18 09:53:54
你用什么作为模板的,基因组?可能你需要的基因在基因组上有多个同源序列,或者你设的引物不是基因特异的。比如说同样的引物在灰盖鬼伞菌的基因组中能扩增17个lac基因片段,序列相似性很低。
2楼2010-06-18 07:55:41
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zsxnd

铁杆木虫 (著名写手)

引用回帖:
Originally posted by zemin_fang at 2010-06-18 07:55:41:
你用什么作为模板的,基因组?可能你需要的基因在基因组上有多个同源序列,或者你设的引物不是基因特异的。比如说同样的引物在灰盖鬼伞菌的基因组中能扩增17个lac基因片段,序列相似性很低。

正解!
3楼2010-06-18 08:53:28
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wangxueqin

金虫 (小有名气)

★ ★
1949stone(金币+2):谢谢交流 2010-06-18 09:13:15
引用回帖:
Originally posted by zemin_fang at 2010-06-18 07:55:41:
你用什么作为模板的,基因组?可能你需要的基因在基因组上有多个同源序列,或者你设的引物不是基因特异的。比如说同样的引物在灰盖鬼伞菌的基因组中能扩增17个lac基因片段,序列相似性很低。

那遇到这样的问题应该怎么办呢?我也有相同的问题啊,是不是要再重新设计引物?如果没有基因组信息,我们又该怎样验证引物的特异性呢,多数情况下是特异性太低而扩不到需要的目的片段。
4楼2010-06-18 09:04:28
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