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虫子739

铁虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】一个基因大概有2500bp左右。很长很长时间了，还没搞定，郁闷！请各位大�已有4人参与

基因全长---一头雾水
植物基因，这个基因包括很多重复序列，大多为 G  I  V  D  R  A  K  D  T  V  G  M  G  P  N重复，也不知道这是什么片段，推测跟抗逆相关。根据GenBank和文献中的序列信息，设计引物，首先获得基因组DNA序列，1700多，和文献中的DNA序列差异较大。用同样的引物，mRNA序列一直没有获得。
现在做RACE，挑取3个克隆，其中两个重复，一个二次PCR产物。发现这二次PCR和一次的序列同源性几乎没有，除了引物序列。Why??
两个重复的克隆同源性还行，但这两个单克隆测序报告中指出不是单克隆，有套峰，明明是单克隆，为什么又这种情况？
谢谢！！
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1楼2010-06-17 23:44:17
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zsxnd

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by zemin_fang at 2010-06-18 07:55:41:
你用什么作为模板的，基因组？可能你需要的基因在基因组上有多个同源序列，或者你设的引物不是基因特异的。比如说同样的引物在灰盖鬼伞菌的基因组中能扩增17个lac基因片段，序列相似性很低。

正解！
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3楼2010-06-18 08:53:28
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zemin_fang

木虫 (正式写手)
★
1949stone(金币+1):谢谢交流 2010-06-18 09:12:59
虫子739(金币+1):我用的RNA为模板，为了拿到ORF区。 2010-06-18 09:53:54
你用什么作为模板的，基因组？可能你需要的基因在基因组上有多个同源序列，或者你设的引物不是基因特异的。比如说同样的引物在灰盖鬼伞菌的基因组中能扩增17个lac基因片段，序列相似性很低。
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2楼2010-06-18 07:55:41
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wangxueqin

金虫 (小有名气)
★ ★
1949stone(金币+2):谢谢交流 2010-06-18 09:13:15
引用回帖:
Originally posted by zemin_fang at 2010-06-18 07:55:41:
你用什么作为模板的，基因组？可能你需要的基因在基因组上有多个同源序列，或者你设的引物不是基因特异的。比如说同样的引物在灰盖鬼伞菌的基因组中能扩增17个lac基因片段，序列相似性很低。

那遇到这样的问题应该怎么办呢？我也有相同的问题啊，是不是要再重新设计引物？如果没有基因组信息，我们又该怎样验证引物的特异性呢，多数情况下是特异性太低而扩不到需要的目的片段。
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4楼2010-06-18 09:04:28
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zemin_fang

木虫 (正式写手)
可以在已有测序信息的基础上设计反向PCR引物，通过反向pCR扩增侧翼序列，可以保证拿到全序列，具体请参考分子克隆上的反向PCR一节。
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5楼2010-06-18 09:33:48
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