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王雨云

金虫 (小有名气)

[交流] 【交流/求助】关于纤维素酶测酶活的问题 已有6人参与

我要测一株真菌的内切葡聚糖酶活力大小,目前遇到的问题是实验组和对照组加DNS煮沸后颜色都很深,对照组是100°煮沸5分钟来灭活后再与实验组一起温育30分钟的方法来测酶活,后来改为:对照组直接加DNS+粗酶液+底物,但这样煮沸后颜色还是很深,看文章有将对照组用NaOH处理后再测酶活,貌似这样处理对照组后颜色就不深了,但不知道是不是由于碱与葡萄糖反应了,加DNS后就不显色了,不一定是强碱使蛋白质变性才导致加DNS后不显色的,不知道有没有人做过这方面的实验,能否解释一下?

[ Last edited by amisking on 2009-12-11 at 22:47 ]
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gj5188

新虫 (初入文坛)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
我也遇到过这种情况,关键是你的酶液本身含有一定量的葡萄糖,将酶液透析或过凝胶柱处理
2楼2009-12-03 21:41:54
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王雨云

金虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by gj5188 at 2009-12-3 21:41:
我也遇到过这种情况,关键是你的酶液本身含有一定量的葡萄糖,将酶液透析或过凝胶柱处理

我直接将发酵液加DNS后煮沸显色,颜色很深,跟加了底物温育之后的颜色都差不多了,不知道是否说明我的这个菌的酶活不高。反正至少可以说明加底物再温育这个过程酶对底物的作用不大。但又觉得葡萄糖的产生应该就是酶的降解作用吧,还真不知道这个该怎么解释了
3楼2009-12-11 19:51:45
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champin110

新虫 (初入文坛)

说明你发酵液当中有一定量的还原糖呀,你发酵培养基中的碳源加的是什么,照你说的那种情况应该是微生物没有怎么利用培养基中的还原糖。
知识...
4楼2009-12-24 14:47:33
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王雨云

金虫 (小有名气)

碳源应该是羧甲基纤维素钠吧,这也是底物。主要是该真菌产的酶把羧甲基纤维素钠降解为还原糖,而且发酵液中还原糖的量还会影响真菌产酶的能力
5楼2010-01-05 15:59:57
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smallcat227

木虫 (著名写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
楼上说的对,透析处理可以,但比较麻烦,可以把粗酶液稀释后再加,这样影响就小多了
6楼2010-01-05 16:19:32
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王雨云

金虫 (小有名气)

也许吧,谢谢楼上的回答
7楼2010-01-16 10:27:23
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85715623

木虫 (正式写手)

发酵培养基成分是一方面因素,可以把对照组加水啊,然后一起反应,煮沸不就解决了吗?
8楼2010-01-16 10:38:42
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秀才ecust

新虫 (初入文坛)

★ ★ ★ ★
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silicare(金币+3): 谢谢参与 2011-01-22 11:07:49
主要有二种情况:第一,底物可能受到酶的污染,时间长了,没有放入冰箱里保存
第二,是酶液本身含有很高的还原性糖,可以稀释,再测,不然测出来是数据偏小!
9楼2011-01-22 05:09:44
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aaa6239

木虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
3楼: Originally posted by 王雨云 at 2009-12-11 19:51:45:
我直接将发酵液加DNS后煮沸显色,颜色很深,跟加了底物温育之后的颜色都差不多了,不知道是否说明我的这个菌的酶活不高。反正至少可以说明加底物再温育这个过程酶对底物的作用不大。但又觉得葡萄糖的产生应该就 ...

既然你直接将发酵液跟DNS反应颜色都很深,那就说明对照里面的还原糖来自酶液。想办法去除酶液本身还有的还原糖或者稀释酶液的还原糖。
但是,用稀释的办法去消除对照中糖的影响,同样会稀释酶。如果粗酶液中酶活力不高的话,稀释后会测不出酶活。
我自己曾经就对这问题非常头痛,后来在培养基中干脆就不加糖类诱导物。
10楼2012-03-10 20:33:58
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