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疯狂修行者

木虫 (正式写手)

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[资源] 【分享】DNA重组实验中的部分技术

DNA重组实验中的常用技术（1）
一、质粒的提取及鉴定
（一）质粒的提取及鉴定
1、收获细菌
（1）将2ml含相应抗生素的LB液体培养基加入到通气良好的15ml的试管中，接入一单菌落，于37℃剧烈振荡培养过夜。
（2）将1.5ml培养物倒入1.5ml离心管中，用台式离心机于4℃以12000g离心5min，将剩余的培养物贮存于4℃。
（3）吸尽培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。
2、碱裂解法小量抽提质粒
（1）将细菌沉淀[上述步骤（3）所得]重悬于100μl预冷的溶液Ⅰ（50mmol/L葡萄糖，25mmol/l Tris –HCl pH8.0, 10mmol/L EDTA）中，剧烈振荡。
（2）加200μl新配制的溶液Ⅱ（0.2mol/l NaOH, 1%SDS），缓和振荡，水浴5min。
（3）加150μl预冷溶液Ⅲ（50mol/L KAC 60ml, 冰乙酸11.5ml,水28.5ml），缓和振荡，冰浴5min。
（4）4℃以12000g离心5min，将上清转移到另一离心管中。
（5）可作不可作：加等量饱和酚，氯仿，振荡混匀，重复2，（4）。
（6）用2倍体积无水乙醇室温沉淀双链，振荡混合，于室温放置2min。
（7）4℃以12000g离心5min。
（8）小心吸尽上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，再将附于管壁的液滴除尽。
（9）用75%乙醇于4℃洗涤，同上离心去上清真空抽干。
（10）加50μl的1×TE（含20μg/ml无酶的胰RNA酶），振荡，贮存于-20℃。
（二）质粒的大量制备
（1）同上1.（1）
（2）将1ml含菌液倒入含相应抗生素的Lb 100ml中，37℃振荡培养至A590 =1.0(5～6h)。
（3）加氯霉素（170μg/ml）扩增，37℃温箱中培养过夜。
（4）收集菌液于离心管中，冰浴10min。3000rpm,离心10min，去上清。
（5）加溶液Ⅰ5ml悬浮菌体，将悬液倒入高速离心管中，摇匀，冰浴5min。
（6）加溶液Ⅱ10ml轻轻混匀，室温下5min。
（7）加溶液Ⅲ7.5ml轻轻混匀，冰浴30min。15000rpm，4℃离心20min。
（8）取上清液于高速离心管中，加2倍体积的无水乙醇，混匀，入-20℃3～5h。
（9）15000rpm 4℃ 离心20min。
（10）弃上清，将离心管倒放入真空泵中抽干（10～15min）。
（11）用5ml1×TE溶解，加入RNase A 15～20μl，42℃水浴4h于过夜。
（12）加入5ml饱和酚，混匀，4000～5000rpm离心5min，取上清液入5ml离心管内。
（13）分别加入2.5ml饱和酚，2.5ml氯仿，混匀后同样离心收集上清。
（14）加等体积氯仿/异戊醇（24：1）混匀，同样离心收集上清。
（15）加入1/10体积的3mol/l NaAc及2倍体积的无水乙醇于-20℃3～5h。
（16）10000rpm 4℃离心20min。
（17）弃上清，加入75%乙醇洗涤2次。
（18）离心弃上清，真空抽干，加入适量1×TE溶解质粒。
（三）质粒的鉴定
1．酶切反应
（1）在0.5ml Eppendorf管中加重蒸水6μl，10×Buffer 1μl， 2μl，酶1μl，混匀，37℃水浴1h以上。
（2）取反应物点样，观察酶切效果。
（3）酶切完全后，70℃5min终止反应。
2．琼脂糖电泳
（1）配制所需浓度琼脂糖凝胶。
（2）在待测的样品中加1/5体积的溴酚蓝指示剂，混匀后点样。
（3）打开电源开关，5V/cm电泳。
（4）在UV灯下观察电泳结果。

[ Last edited by amisking on 2009-12-8 at 21:33 ]

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