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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 干扰/敲除 » 植物基因敲低表达，用CRISPR还是用RNAi？
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hellohuo

金虫 (小有名气)

[求助] 植物基因敲低表达，用CRISPR还是用RNAi？ 已有2人参与

最近想要做植物内某个基因的沉默，一直纠结于用Crispr，还是用传统的RNAi技术，我的目的想要看该基因敲低后的相关生理状态，并不一定非要敲除，担心彻底敲除某个基因会引起其他生理反应，而不是我预期的生理现象。因此，想求教各位大神，这两个技术手段的优缺点，针对我的实验目的，有没有大神可以给点建议？谢谢！
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1楼 2020-11-26 14:58:08
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更深的蓝888

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
hellohuo: 金币+15, ★★★很有帮助, 感谢您的回答，明白了很多！ 2021-02-20 09:36:55
引用回帖:
8楼: Originally posted by hellohuo at 2020-12-12 09:21:04
还有想问问，CRISPR对于多倍体的植物来说，如果想要拿到纯合的突变体材料，是不是在转化完之后，第一代转基因株系还得进行回交或者自交？一到两代后，才能拿到纯合体，看表型？CRISPR小白，纯好奇问，谢谢！...

1：研究对象是拟南芥？是单子叶植物还是双子叶植物？载体不同侵染物种不同，但无论是什么植物基本上CRISPR都需要构建双元载体，U6启动子的中间载体，及连接Cas9的表达载体（pYAO-AtU6-Cas9侵染拟南芥，而pCA1300-OsU6-Cas9适合水稻）
2：理论上讲Cas9会切割基因组DNA双链，再设计sgRNA靶点NGG，的N位点，DNA利用修复产生错配，造成替换，串码，提前终止，再侵染完成后的T1代就能拿到纯合株系！注意，此时的纯合株系里含有Cas9融合蛋白，需于野生型杂交将Cas9分离筛掉
3: 若是你的基因功能在植物生长发育阶段起到了重要功能，若是缺失了，肯定会有表型的（包括杂合）
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天若有情天亦老
9楼2020-12-12 13:47:51
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草溪河

铁虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
hellohuo: 金币+5, ★★★很有帮助, 感谢您的回答，明白了很多！ 2021-02-20 09:38:45
基于你的描述和研究目的，建议还是做RNAi吧。通常来说，RNAi是降低基因的表达量，即knock-down，但不会完全使基因功能丧失（多数情况下），而CRISPR介导的基因敲除（knock-out），顾名思义，通过在基因编码区引入碱基缺失或插入，造成移码突变或提前终止翻译等，可以实现将基因功能完成丧失。
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hellohuo
2楼2020-11-28 13:31:27
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hellohuo

金虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by 草溪河 at 2020-11-28 13:31:27
基于你的描述和研究目的，建议还是做RNAi吧。通常来说，RNAi是降低基因的表达量，即knock-down，但不会完全使基因功能丧失（多数情况下），而CRISPR介导的基因敲除（knock-out），顾名思义，通过在基因编码区引入碱 ...

还想请教一下，基于目前所有关于敲低与敲除的实验，感觉用CRISPR的比较多，而RNAi逐渐变少了，是因为RNAi的技术存在某种问题？还是说大家都朝着新技术CRISPR发展？我觉得彻底敲除可能会造成生理功能的其他连锁变化。因为有些基因对于发育还是挺重要的，直接敲除，可能除了它本身的功能，也连带会出现别的生理变化，这种并不能说明连带的功能就是这个基因本身的功能。我觉得别人肯定也有考虑到这个问题，但是为什么大家还选择CRISPR呢？因为我对这个技术不是很了解，所以有哪些原因是我没想到的，求指教！谢谢！！！
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3楼2020-12-02 09:14:29
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草溪河

铁虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by hellohuo at 2020-12-02 09:14:29
还想请教一下，基于目前所有关于敲低与敲除的实验，感觉用CRISPR的比较多，而RNAi逐渐变少了，是因为RNAi的技术存在某种问题？还是说大家都朝着新技术CRISPR发展？我觉得彻底敲除可能会造成生理功能的其他连锁变化 ...

大家还选择CRISPR进行基因功能研究，，最主要的还是该技术可以实现基因敲除，更确定地是突变体材料的定制，理论上可以实现任意位点的核苷酸序列的改变（编辑），比如特定的编码区、结构域、顺势作用元件、内含子等。其次，CRISPR技术获得材料最后是可以不含外源T-DNA的，意味着在生产上应用的潜力加大，同时更重要的是可以在此基础上再次进行其他基因的敲除，实现多基因敲除（当合理设计携带多个sgRNA也能轻易地进行多基因敲除）。由于CRIPSR的高特异性，对于相似度极高的同源基因也能很好地实现靶基因的敲除。
选择CRISPR还是RNAi，关键取决于各自的试验内容及目的吧，毕竟这俩只是单纯的技术而已，各有有缺，合理使用即可。
你之前有相关的实验数据表明该基因敲除对发育有严重影响吗？
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hellohuo hellohuo
4楼2020-12-02 12:01:36
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