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hellohuo金虫 (小有名气)
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植物基因敲低表达，用CRISPR还是用RNAi？ 已有2人参与
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| 最近想要做植物内某个基因的沉默，一直纠结于用Crispr，还是用传统的RNAi技术，我的目的想要看该基因敲低后的相关生理状态，并不一定非要敲除，担心彻底敲除某个基因会引起其他生理反应，而不是我预期的生理现象。因此，想求教各位大神，这两个技术手段的优缺点，针对我的实验目的，有没有大神可以给点建议？谢谢！ |
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2楼2020-11-28 13:31:27
7楼2020-12-09 20:01:01
hellohuo
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3楼2020-12-02 09:14:29
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大家还选择CRISPR进行基因功能研究，，最主要的还是该技术可以实现基因敲除，更确定地是突变体材料的定制，理论上可以实现任意位点的核苷酸序列的改变（编辑），比如特定的编码区、结构域、顺势作用元件、内含子等。其次，CRISPR技术获得材料最后是可以不含外源T-DNA的，意味着在生产上应用的潜力加大，同时更重要的是可以在此基础上再次进行其他基因的敲除，实现多基因敲除（当合理设计携带多个sgRNA也能轻易地进行多基因敲除）。由于CRIPSR的高特异性，对于相似度极高的同源基因也能很好地实现靶基因的敲除。 选择CRISPR还是RNAi，关键取决于各自的试验内容及目的吧，毕竟这俩只是单纯的技术而已，各有有缺，合理使用即可。 你之前有相关的实验数据表明该基因敲除对发育有严重影响吗？ |
4楼2020-12-02 12:01:36
hellohuo
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送红花一朵 |
还没开始做那么深层研究，只是查了一下相关文献，是开花相关的基因，因为这个基因主要功能负责开花，如果敲除了，我担心的是除了能够看到后续开花的功能被影响了，也可能会因为开花缺失导致植物碳流分配的问题，这样牵一发动全身。因为我只是想看开花过程中，该基因在负责的那部分功能，因为开花这个生理过程是被多基因调控的，而不是开花的缺失对植物的影响。所以我一直在纠结，主要想敲低该基因功能，但是又不影响植物生存，又能看到该基因对开花的过程的影响。 因为对这两个技术只是听闻过，也查过资料，我不清楚为什么大家都抛弃了RNAi，而选择了CRISPR，是否RNAi存在某种技术缺点，而被停用，还是CRISPR有某些更优势的能力，因为有一些技术层面的东西没有写在文章里，所以想请教请教专业的人，帮忙解惑。 |
5楼2020-12-08 11:24:14
hellohuo
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还没开始做那么深层研究，只是查了一下相关文献，是开花相关的基因，因为这个基因主要功能负责开花，如果敲除了，我担心的是除了能够看到后续开花的功能被影响了，也可能会因为开花缺失导致植物碳流分配的问题，这样牵一发动全身。因为我只是想看开花过程中，该基因在负责的那部分功能，因为开花这个生理过程是被多基因调控的，而不是开花的缺失对植物的影响。所以我一直在纠结，主要想敲低该基因功能，但是又不影响植物生存，又能看到该基因对开花的过程的影响。 因为对这两个技术只是听闻过，也查过资料，我不清楚为什么大家都抛弃了RNAi，而选择了CRISPR，是否RNAi存在某种技术缺点，而被停用，还是CRISPR有某些更优势的能力，因为有一些技术层面的东西没有写在文章里，所以想请教请教专业的人，帮忙解惑。 |
6楼2020-12-08 11:24:30
hellohuo
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8楼2020-12-12 09:21:04
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
hellohuo: 金币+15, ★★★很有帮助, 感谢您的回答，明白了很多！ 2021-02-20 09:36:55
hellohuo: 金币+15, ★★★很有帮助, 感谢您的回答，明白了很多！ 2021-02-20 09:36:55
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1：研究对象是拟南芥？是单子叶植物还是双子叶植物？载体不同侵染物种不同，但无论是什么植物基本上CRISPR都需要构建双元载体，U6启动子的中间载体，及连接Cas9的表达载体（pYAO-AtU6-Cas9侵染拟南芥，而pCA1300-OsU6-Cas9适合水稻） 2：理论上讲Cas9会切割基因组DNA双链，再设计sgRNA靶点NGG，的N位点，DNA利用修复产生错配，造成替换，串码，提前终止，再侵染完成后的T1代就能拿到纯合株系！注意，此时的纯合株系里含有Cas9融合蛋白，需于野生型杂交将Cas9分离筛掉 3: 若是你的基因功能在植物生长发育阶段起到了重要功能，若是缺失了，肯定会有表型的（包括杂合） |
9楼2020-12-12 13:47:51
zeping_bio 
禁虫 (初入文坛)
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本帖内容被屏蔽 |
10楼2020-12-18 14:16:23
