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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 电泳拖尾
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Misterboy

铁虫 (正式写手)

[求助] 电泳拖尾 已有2人参与

用MixTaq酶PCR，跑电泳没问题,有目标产物，用高保真酶PCR后，50uL全部电泳，准备胶回收纯化DNA，可是电泳完了，产物严重拖尾，没有清晰的目的条带，请问这是怎么回事？请求大神解答@飞约疯人院@biostar2009@wizardfan@youlinglyw
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1楼 2019-04-07 19:24:58
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KM石头

金虫 (正式写手)
★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2019-04-09 22:04:02
给楼主一些建议吧，不敢说一定能解决问题。1.更换电泳液 2.调整PCR体系，高保真酶模板加多了可能出现类似情况 3.可以考虑提高一下退火温度

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2楼2019-04-08 00:25:25
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Misterboy

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by KM石头 at 2019-04-08 00:25:25
给楼主一些建议吧，不敢说一定能解决问题。1.更换电泳液 2.调整PCR体系，高保真酶模板加多了可能出现类似情况 3.可以考虑提高一下退火温度

谢谢答复，电泳前已经更换了TAE，退火温度已经65度了，现在换了一种高保真酶在做，希望能做出来吧

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3楼2019-04-08 13:06:45
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KM石头

金虫 (正式写手)
楼主用的是哪家的高保真酶，退火温度好高啊，我用takara的高保真酶，一般是55度，最高56，57度

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Misterboy
4楼2019-04-08 15:54:14
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macgray1

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2019-04-09 22:04:31
高保真酶的扩增效率是不如Taq酶的，楼主估计需要重新优化下反应条件了，如果还不行，就不能用高保真酶扩了
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» 本帖已获得的红花（最新10朵）

Misterboy
5楼2019-04-08 16:52:19
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Misterboy

铁虫 (正式写手)
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引用回帖:
4楼: Originally posted by KM石头 at 2019-04-08 15:54:14
楼主用的是哪家的高保真酶，退火温度好高啊，我用takara的高保真酶，一般是55度，最高56，57度

我是在筛选条件，发现只有65左右时才会合成目的片段

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6楼2019-04-09 09:10:20
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Misterboy

铁虫 (正式写手)
送红花一朵
引用回帖:
5楼: Originally posted by macgray1 at 2019-04-08 16:52:19
高保真酶的扩增效率是不如Taq酶的，楼主估计需要重新优化下反应条件了，如果还不行，就不能用高保真酶扩了

嗯嗯，正在用高保真酶优化反应条件了

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7楼2019-04-09 09:12:01
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Misterboy

铁虫 (正式写手)
最后验证了，引物加少了，而且模版DNA有点污染

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8楼2019-04-09 23:28:01
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厚德求是

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
没P出来，做一个退火温度梯度吧。55-65做八个，看哪一个能P出来，如果还不行，重新设计引物，换思路吧。

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9楼2019-04-10 13:43:55
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Misterboy

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 厚德求是 at 2019-04-10 13:43:55
没P出来，做一个退火温度梯度吧。55-65做八个，看哪一个能P出来，如果还不行，重新设计引物，换思路吧。

嗯嗯，感谢
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10楼2019-04-17 12:27:24
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