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Misterboy

铁虫 (正式写手)

[求助] 电泳拖尾已有2人参与

用MixTaq酶PCR,跑电泳没问题,有目标产物,用高保真酶PCR后,50uL全部电泳,准备胶回收纯化DNA,可是电泳完了,产物严重拖尾,没有清晰的目的条带,请问这是怎么回事?请求大神解答@飞约疯人院@biostar2009@wizardfan@youlinglyw
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KM石头

金虫 (正式写手)

★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2019-04-09 22:04:02
给楼主一些建议吧,不敢说一定能解决问题。1.更换电泳液 2.调整PCR体系,高保真酶模板加多了可能出现类似情况 3.可以考虑提高一下退火温度

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2楼2019-04-08 00:25:25
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Misterboy

铁虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by KM石头 at 2019-04-08 00:25:25
给楼主一些建议吧,不敢说一定能解决问题。1.更换电泳液 2.调整PCR体系,高保真酶模板加多了可能出现类似情况 3.可以考虑提高一下退火温度

谢谢答复,电泳前已经更换了TAE,退火温度已经65度了,现在换了一种高保真酶在做,希望能做出来吧

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3楼2019-04-08 13:06:45
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KM石头

金虫 (正式写手)

楼主用的是哪家的高保真酶,退火温度好高啊,我用takara的高保真酶,一般是55度,最高56,57度

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» 本帖已获得的红花(最新10朵)

4楼2019-04-08 15:54:14
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macgray1

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2019-04-09 22:04:31
高保真酶的扩增效率是不如Taq酶的,楼主估计需要重新优化下反应条件了,如果还不行,就不能用高保真酶扩了

» 本帖已获得的红花(最新10朵)

5楼2019-04-08 16:52:19
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Misterboy

铁虫 (正式写手)

送红花一朵
引用回帖:
4楼: Originally posted by KM石头 at 2019-04-08 15:54:14
楼主用的是哪家的高保真酶,退火温度好高啊,我用takara的高保真酶,一般是55度,最高56,57度

我是在筛选条件,发现只有65左右时才会合成目的片段

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6楼2019-04-09 09:10:20
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Misterboy

铁虫 (正式写手)

送红花一朵
引用回帖:
5楼: Originally posted by macgray1 at 2019-04-08 16:52:19
高保真酶的扩增效率是不如Taq酶的,楼主估计需要重新优化下反应条件了,如果还不行,就不能用高保真酶扩了

嗯嗯,正在用高保真酶优化反应条件了

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7楼2019-04-09 09:12:01
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Misterboy

铁虫 (正式写手)

最后验证了,引物加少了,而且模版DNA有点污染

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8楼2019-04-09 23:28:01
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厚德求是

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
没P出来,做一个退火温度梯度吧。55-65做八个,看哪一个能P出来,如果还不行,重新设计引物,换思路吧。

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9楼2019-04-10 13:43:55
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Misterboy

铁虫 (正式写手)

引用回帖:
9楼: Originally posted by 厚德求是 at 2019-04-10 13:43:55
没P出来,做一个退火温度梯度吧。55-65做八个,看哪一个能P出来,如果还不行,重新设计引物,换思路吧。

嗯嗯,感谢
10楼2019-04-17 12:27:24
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