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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 载体双酶切连接总是自连
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麦芽tian

新虫 (初入文坛)

[求助] 载体双酶切连接总是自连 已有2人参与

pCDH质粒中连入500bp左右的片段，酶切位点为XbaI 和BamH I，质粒做双酶切时同时做了单酶切单酶切对照，，单酶切都能够切开，双酶切也能切成一条线型条带，插入片段为PCR产物，乙醇回收后做双酶切。16℃连接过夜后转化，长出的菌落PCR都是阴性,不加插入片段的对照组和实验组长出的菌落数量差不多，有时候对照组菌落甚至更多，已经做了好几次了，不知道什么原因，求解答
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1楼 2018-10-11 11:00:44
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匿名

用户注销 (小有名气)
★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
麦芽tian: 金币+3, ★★★很有帮助 2018-10-12 10:35:38
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2楼2018-10-11 13:24:10
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麦芽tian

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 1204539997 at 2018-10-11 13:24:10
质粒没有切完全吧，质粒是用的切胶回收吗。优化下酶切体系，实在不行的话换个酶切位点。还有酶连体系片段多加点，质粒和片段摩尔比1比5试试？

谢谢解答，质粒酶切后用的乙醇沉淀回收，两个酶切位点之间大概有十几bp吧，连接的时候载体和插入片段没有测浓度，是根据电泳亮度估测的，比例在1:5到1:10之间，一直连不上，后来又增加了插入片段的比例，在20μl体系中处除了T4连接酶，buffer和质粒，其余都用插入片段补足体积，还是没有连上。之前用这个质粒插入另两个片段，用的EcorR I和BamHI 这两个位点，其中一个片段连上了，但是阳性率特别低，长出的菌落也很少，另一个片段也是始终没连上
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3楼2018-10-11 15:07:03
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我欲乘风归去

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 麦芽tian at 2018-10-11 15:07:03
谢谢解答，质粒酶切后用的乙醇沉淀回收，两个酶切位点之间大概有十几bp吧，连接的时候载体和插入片段没有测浓度，是根据电泳亮度估测的，比例在1:5到1:10之间，一直连不上，后来又增加了插入片段的比例，在20μl体 ...

如果用乙醇沉淀回收，切下来的10几bp也会回收，连接的时候片段越小越容易连上，你这种情况自连严重，最好用胶回收。但是胶回收的产率特别低，你需要酶切至少3ug以上的质粒，要不然回收后基本什么都没有了。如果实在不行，买一个无缝克隆试剂盒吧，推荐诺唯赞的，价廉物美。
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。
4楼2018-10-11 15:40:36
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麦芽tian

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 我欲乘风归去 at 2018-10-11 15:40:36
如果用乙醇沉淀回收，切下来的10几bp也会回收，连接的时候片段越小越容易连上，你这种情况自连严重，最好用胶回收。但是胶回收的产率特别低，你需要酶切至少3ug以上的质粒，要不然回收后基本什么都没有了。如果实在 ...

谢谢，实验室的胶回收试剂盒放置了很长时间，现在回收效率不是很稳定，后来就没在用了，我用胶回收试试效果吧
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5楼2018-10-11 15:57:22
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fjtony163

版主 (文坛精英)

米米

优秀版主优秀版主优秀版主优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
如果载体自连的话 用rsap酶处理一下末端 去掉五端磷酸化 就不会自连了
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6楼2018-10-12 01:06:29
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ken19860823

木虫 (正式写手)
片段回收两次浓度不可控 建议t克隆后从亚克隆载体切下来跟目标载体连 双酶切一般不考虑自连问题 。除非自连很多就查下是否同尾酶。

发自小木虫IOS客户端
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做基因修饰的老菜鸡
7楼2018-10-12 08:14:54
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麦芽tian

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by ken19860823 at 2018-10-12 08:14:54
片段回收两次浓度不可控 建议t克隆后从亚克隆载体切下来跟目标载体连 双酶切一般不考虑自连问题 。除非自连很多就查下是否同尾酶。

不是同尾酶，那双酶切有自连现象应该就是没切完全或者只有一端切开了？
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8楼2018-10-12 09:43:42
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