应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 载体双酶切连接总是自连
51/1返回列表
查看: 12096  |  回复: 7
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

麦芽tian

新虫 (初入文坛)

[求助] 载体双酶切连接总是自连 已有2人参与

pCDH质粒中连入500bp左右的片段，酶切位点为XbaI 和BamH I，质粒做双酶切时同时做了单酶切单酶切对照，，单酶切都能够切开，双酶切也能切成一条线型条带，插入片段为PCR产物，乙醇回收后做双酶切。16℃连接过夜后转化，长出的菌落PCR都是阴性,不加插入片段的对照组和实验组长出的菌落数量差不多，有时候对照组菌落甚至更多，已经做了好几次了，不知道什么原因，求解答
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2018-10-11 11:00:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

麦芽tian

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by ken19860823 at 2018-10-12 08:14:54
片段回收两次浓度不可控 建议t克隆后从亚克隆载体切下来跟目标载体连 双酶切一般不考虑自连问题 。除非自连很多就查下是否同尾酶。

不是同尾酶，那双酶切有自连现象应该就是没切完全或者只有一端切开了？
赞一下 回复此楼
8楼2018-10-12 09:43:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 8 个回答

匿名

用户注销 (小有名气)
★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
麦芽tian: 金币+3, ★★★很有帮助 2018-10-12 10:35:38
本帖仅楼主可见
赞一下
2楼2018-10-11 13:24:10
已阅   申请MolEPI   回复此楼   编辑   查看我的主页

麦芽tian

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 1204539997 at 2018-10-11 13:24:10
质粒没有切完全吧，质粒是用的切胶回收吗。优化下酶切体系，实在不行的话换个酶切位点。还有酶连体系片段多加点，质粒和片段摩尔比1比5试试？

谢谢解答，质粒酶切后用的乙醇沉淀回收，两个酶切位点之间大概有十几bp吧，连接的时候载体和插入片段没有测浓度，是根据电泳亮度估测的，比例在1:5到1:10之间，一直连不上，后来又增加了插入片段的比例，在20μl体系中处除了T4连接酶，buffer和质粒，其余都用插入片段补足体积，还是没有连上。之前用这个质粒插入另两个片段，用的EcorR I和BamHI 这两个位点，其中一个片段连上了，但是阳性率特别低，长出的菌落也很少，另一个片段也是始终没连上
赞一下 回复此楼
3楼2018-10-11 15:07:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

我欲乘风归去

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 麦芽tian at 2018-10-11 15:07:03
谢谢解答，质粒酶切后用的乙醇沉淀回收，两个酶切位点之间大概有十几bp吧，连接的时候载体和插入片段没有测浓度，是根据电泳亮度估测的，比例在1:5到1:10之间，一直连不上，后来又增加了插入片段的比例，在20μl体 ...

如果用乙醇沉淀回收，切下来的10几bp也会回收，连接的时候片段越小越容易连上，你这种情况自连严重，最好用胶回收。但是胶回收的产率特别低，你需要酶切至少3ug以上的质粒，要不然回收后基本什么都没有了。如果实在不行，买一个无缝克隆试剂盒吧，推荐诺唯赞的，价廉物美。
赞一下(1人) 回复此楼
。
4楼2018-10-11 15:40:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 8 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 292求调剂 +8 鹅鹅鹅额额额额� 2026-03-25 9/450 2026-03-26 12:21 by 张凯十八号
[考研] 一志愿上海交大生物与医药专硕324分，求调剂 +6 jiajunX 2026-03-22 6/300 2026-03-25 23:05 by licg0208
[考研] 299求调剂 +4 15188958825 2026-03-25 4/200 2026-03-25 22:56 by 418490947
[考研] 07化学303求调剂 +5 睿08 2026-03-25 5/250 2026-03-25 22:46 by 418490947
[考研] 材料与化工328分调剂 +6 。，。，。，。i 2026-03-23 6/300 2026-03-25 22:30 by 418490947
[考研] 334分 一志愿武理-080500 材料求调剂 +4 李李不服输 2026-03-25 4/200 2026-03-25 21:26 by 星空星月
[考研] 材料调剂 +3 iwinso 2026-03-23 3/150 2026-03-25 11:29 by greychen00
[考研] 考研化学308分求调剂 +10 你好明天你好 2026-03-23 11/550 2026-03-25 10:23 by userper
[考研] 求调剂 一志愿 本科 北科大 化学 343 +4 13831862839 2026-03-24 5/250 2026-03-25 09:47 by 无际的草原
[考研] 上海电力大学材料防护与新材料重点实验室招收调剂研究生（材料、化学、电化学，环境） +4 我爱学电池 2026-03-23 4/200 2026-03-25 00:59 by 1027_324
[考研] 291求调剂 +3 HanBeiNingZC 2026-03-24 3/150 2026-03-24 16:34 by barlinike
[考研] 化学308分求调剂 +3 你好明天你好 2026-03-23 3/150 2026-03-23 20:11 by macy2011
[考研] 070300，一志愿北航320求调剂 +3 Jerry0216 2026-03-22 5/250 2026-03-23 09:16 by 。。堂堂
[考研] 石河子大学（211、双一流）硕博研究生长期招生公告 +3 李子目 2026-03-22 3/150 2026-03-22 21:01 by 怎么释怀
[考研] 324求调剂 +6 lucky呀呀呀鸭 2026-03-20 6/300 2026-03-22 16:01 by ColorlessPI
[考研] 269专硕求调剂 +6 金恩贝 2026-03-21 6/300 2026-03-22 14:31 by ColorlessPI
[考研] 一志愿深大，0703化学，总分302，求调剂 +4 七月-七七 2026-03-21 4/200 2026-03-21 18:20 by 学员8dgXkO
[考研] 330求调剂0854 +3 assdll 2026-03-21 3/150 2026-03-21 13:01 by 搏击518
[考研] 22408 344分 求调剂 一志愿 华电计算机技术 +4 solanXXX 2026-03-20 4/200 2026-03-20 23:49 by alg094825
[考研] 一志愿西南交通 专硕 材料355 本科双非 求调剂 +5 西南交通专材355 2026-03-19 5/250 2026-03-20 21:10 by JourneyLucky
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭