应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 载体双酶切连接总是自连
51/1返回列表
查看: 12333  |  回复: 7
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

麦芽tian

新虫 (初入文坛)

[求助] 载体双酶切连接总是自连 已有2人参与

pCDH质粒中连入500bp左右的片段，酶切位点为XbaI 和BamH I，质粒做双酶切时同时做了单酶切单酶切对照，，单酶切都能够切开，双酶切也能切成一条线型条带，插入片段为PCR产物，乙醇回收后做双酶切。16℃连接过夜后转化，长出的菌落PCR都是阴性,不加插入片段的对照组和实验组长出的菌落数量差不多，有时候对照组菌落甚至更多，已经做了好几次了，不知道什么原因，求解答
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2018-10-11 11:00:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

麦芽tian

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 1204539997 at 2018-10-11 13:24:10
质粒没有切完全吧，质粒是用的切胶回收吗。优化下酶切体系，实在不行的话换个酶切位点。还有酶连体系片段多加点，质粒和片段摩尔比1比5试试？

谢谢解答，质粒酶切后用的乙醇沉淀回收，两个酶切位点之间大概有十几bp吧，连接的时候载体和插入片段没有测浓度，是根据电泳亮度估测的，比例在1:5到1:10之间，一直连不上，后来又增加了插入片段的比例，在20μl体系中处除了T4连接酶，buffer和质粒，其余都用插入片段补足体积，还是没有连上。之前用这个质粒插入另两个片段，用的EcorR I和BamHI 这两个位点，其中一个片段连上了，但是阳性率特别低，长出的菌落也很少，另一个片段也是始终没连上
赞一下 回复此楼
3楼2018-10-11 15:07:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 8 个回答

匿名

用户注销 (小有名气)
★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
麦芽tian: 金币+3, ★★★很有帮助 2018-10-12 10:35:38
本帖仅楼主可见
赞一下
2楼2018-10-11 13:24:10
已阅   申请MolEPI   回复此楼   编辑   查看我的主页

我欲乘风归去

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 麦芽tian at 2018-10-11 15:07:03
谢谢解答，质粒酶切后用的乙醇沉淀回收，两个酶切位点之间大概有十几bp吧，连接的时候载体和插入片段没有测浓度，是根据电泳亮度估测的，比例在1:5到1:10之间，一直连不上，后来又增加了插入片段的比例，在20μl体 ...

如果用乙醇沉淀回收，切下来的10几bp也会回收，连接的时候片段越小越容易连上，你这种情况自连严重，最好用胶回收。但是胶回收的产率特别低，你需要酶切至少3ug以上的质粒，要不然回收后基本什么都没有了。如果实在不行，买一个无缝克隆试剂盒吧，推荐诺唯赞的，价廉物美。
赞一下(1人) 回复此楼
。
4楼2018-10-11 15:40:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

麦芽tian

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 我欲乘风归去 at 2018-10-11 15:40:36
如果用乙醇沉淀回收，切下来的10几bp也会回收，连接的时候片段越小越容易连上，你这种情况自连严重，最好用胶回收。但是胶回收的产率特别低，你需要酶切至少3ug以上的质粒，要不然回收后基本什么都没有了。如果实在 ...

谢谢，实验室的胶回收试剂盒放置了很长时间，现在回收效率不是很稳定，后来就没在用了，我用胶回收试试效果吧
赞一下 回复此楼
5楼2018-10-11 15:57:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 8 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 应该是93bebmhtak前后十一个字符比较关键 +19 Lanmanbaby 2026-08-09 32/1600 2026-08-12 09:56 by gltch
[论文投稿] 职称评审，求友友推荐见刊最快的期刊 +4 工厂打螺丝 2026-08-08 4/200 2026-08-12 09:18 by hansi2025
[基金申请] 小木虫上这么多卖论文的，真有人买论文么？感觉没必要啊 +8 Tide man 2026-08-10 9/450 2026-08-11 20:39 by beefly
[基金申请] 有时候，自然基金真的不能太认真 （我的申报经验） +3 majunge000 2026-08-11 4/200 2026-08-11 20:13 by lch2012
[基金申请] 为什么网上很多人说本周 12号出结果 +6 瞬息宇宙 2026-08-10 7/350 2026-08-11 19:25 by Tide man
[基金申请] 分享一下我之前已中青C的计划书的filecode +3 布布和一二 2026-08-11 4/200 2026-08-11 15:20 by aasahr
[基金申请] 听说今天filecode变了 +26 布布和一二 2026-08-06 49/2450 2026-08-11 13:18 by WH3796
[基金申请] FileCode能看出啥？ +7 要乐观耀哥 2026-08-10 17/850 2026-08-11 10:50 by 要乐观耀哥
[基金申请] 关于代码变化问题，想知道的进来 +17 且听虎啸 2026-08-07 24/1200 2026-08-10 18:35 by zhangduo2008
[基金申请] 静等基金结果 +5 gjjjzhong 2026-08-10 16/800 2026-08-10 17:19 by Tide man
[基金申请] 关于Filecode分析方法 +3 majunge000 2026-08-10 3/150 2026-08-10 15:46 by lch2012
[基金申请] 国自然结果 +4 Vierhys 2026-08-10 8/400 2026-08-10 15:06 by Vierhys
[基金申请] 面上项目filecode邪修 +5 西山十月 2026-08-09 7/350 2026-08-10 07:32 by 仁砚薪传
[基金申请] fileCode有新解读？ +10 Tide man 2026-08-08 18/900 2026-08-09 12:55 by 仁砚薪传
[基金申请] 关于filecode，很负责任的告诉大家 +6 爱看书的可乐 2026-08-08 7/350 2026-08-08 22:13 by a_niu
[基金申请] 关于豆爷回答的JTJC与%2F数量 +5 yang182083 2026-08-06 7/350 2026-08-08 18:29 by zhanghaozhu
[基金申请] 国基金的申报应该改成非等额制，评价高的钱多评价低的钱少，但是增加资助率 +7 a089 2026-08-07 7/350 2026-08-08 18:05 by gltch
[基金申请] 化学口download_prp&fileCode的固定段好像这几天一直没变，有变的大神么？ +3 Tide man 2026-08-07 4/200 2026-08-07 22:39 by Tide man
[基金申请] filecode +14 等待解的谜 2026-08-06 19/950 2026-08-07 12:20 by wlwhappy
[基金申请] filecode +8 布布和一二 2026-08-06 11/550 2026-08-06 20:41 by tangpu318
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭