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麦芽tian

新虫 (初入文坛)

[求助] 载体双酶切连接总是自连已有2人参与

pCDH质粒中连入500bp左右的片段,酶切位点为XbaI 和BamH I,质粒做双酶切时同时做了单酶切单酶切对照,,单酶切都能够切开,双酶切也能切成一条线型条带,插入片段为PCR产物,乙醇回收后做双酶切。16℃连接过夜后转化,长出的菌落PCR都是阴性,不加插入片段的对照组和实验组长出的菌落数量差不多,有时候对照组菌落甚至更多,已经做了好几次了,不知道什么原因,求解答
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匿名

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麦芽tian: 金币+3, ★★★很有帮助 2018-10-12 10:35:38
本帖仅楼主可见
2楼2018-10-11 13:24:10
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麦芽tian

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 1204539997 at 2018-10-11 13:24:10
质粒没有切完全吧,质粒是用的切胶回收吗。优化下酶切体系,实在不行的话换个酶切位点。还有酶连体系片段多加点,质粒和片段摩尔比1比5试试?

谢谢解答,质粒酶切后用的乙醇沉淀回收,两个酶切位点之间大概有十几bp吧,连接的时候载体和插入片段没有测浓度,是根据电泳亮度估测的,比例在1:5到1:10之间,一直连不上,后来又增加了插入片段的比例,在20μl体系中处除了T4连接酶,buffer和质粒,其余都用插入片段补足体积,还是没有连上。之前用这个质粒插入另两个片段,用的EcorR I和BamHI 这两个位点,其中一个片段连上了,但是阳性率特别低,长出的菌落也很少,另一个片段也是始终没连上
3楼2018-10-11 15:07:03
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我欲乘风归去

木虫 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 麦芽tian at 2018-10-11 15:07:03
谢谢解答,质粒酶切后用的乙醇沉淀回收,两个酶切位点之间大概有十几bp吧,连接的时候载体和插入片段没有测浓度,是根据电泳亮度估测的,比例在1:5到1:10之间,一直连不上,后来又增加了插入片段的比例,在20μl体 ...

如果用乙醇沉淀回收,切下来的10几bp也会回收,连接的时候片段越小越容易连上,你这种情况自连严重,最好用胶回收。但是胶回收的产率特别低,你需要酶切至少3ug以上的质粒,要不然回收后基本什么都没有了。如果实在不行,买一个无缝克隆试剂盒吧,推荐诺唯赞的,价廉物美。
4楼2018-10-11 15:40:36
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麦芽tian

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 我欲乘风归去 at 2018-10-11 15:40:36
如果用乙醇沉淀回收,切下来的10几bp也会回收,连接的时候片段越小越容易连上,你这种情况自连严重,最好用胶回收。但是胶回收的产率特别低,你需要酶切至少3ug以上的质粒,要不然回收后基本什么都没有了。如果实在 ...

谢谢,实验室的胶回收试剂盒放置了很长时间,现在回收效率不是很稳定,后来就没在用了,我用胶回收试试效果吧
5楼2018-10-11 15:57:22
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fjtony163

版主 (文坛精英)

米米

优秀版主优秀版主优秀版主优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

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如果载体自连的话 用rsap酶处理一下末端 去掉五端磷酸化 就不会自连了
6楼2018-10-12 01:06:29
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ken19860823

木虫 (正式写手)

片段回收两次浓度不可控 建议t克隆后从亚克隆载体切下来跟目标载体连 双酶切一般不考虑自连问题 。除非自连很多就查下是否同尾酶。

发自小木虫IOS客户端
做基因修饰的老菜鸡
7楼2018-10-12 08:14:54
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麦芽tian

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
7楼: Originally posted by ken19860823 at 2018-10-12 08:14:54
片段回收两次浓度不可控 建议t克隆后从亚克隆载体切下来跟目标载体连 双酶切一般不考虑自连问题 。除非自连很多就查下是否同尾酶。

不是同尾酶,那双酶切有自连现象应该就是没切完全或者只有一端切开了?
8楼2018-10-12 09:43:42
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