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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR扩增的条件设计，求助！
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mulinxz

新虫 (小有名气)

[求助] PCR扩增的条件设计，求助！ 已有1人参与

我做微生物的，我有一株菌株的质粒进行全测序了，我要扩增里面的一个基因，引物设计好了，由于要扩这基因的全长，引物并不是那么的完美，现在怎么设计pcr反应条件，模板gc含量0.65，怎么办？我这个学渣不知道怎么办了，求大神帮助！！！

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1楼 2017-08-10 08:55:24
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chiden

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
首先，你可以先试试用高保真酶扩增，一种不行，换一种再试试，好多高GC含量的片段也能拿到的，不同的高保真酶的延伸温度和效率是有不同的，你需要参照所用的酶的说明。
例如：你用的takara的高保真酶KOD，它的延伸温度就是68℃，好多其他的酶是72℃。几乎大多高保真酶的延伸效率都很好，30s/1kb。也有更快的，这里就不细讲了，要看酶的说明书！！！
具体条件，说明书上一般会给出一个参考模板，根据这个模板可以自行调整，直至拿到目的片段为止。
希望对你能有所帮助
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即使难过，也要微笑着走下去
2楼2017-08-10 10:57:39
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幻影望晴

新虫 (初入文坛)
第一，买高保真酶，建议takara家的，也可以是Vazyme，根据说明书设置首先，进行退火温度梯度筛选，

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3楼2017-08-10 16:54:13
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幻影望晴

新虫 (初入文坛)
手残 按了发送请原谅，继续哈！第二，退火温度选择，一般设计引物的Tm值为60以上，根据实际情况，从引物低5度开始设置梯度，间隔2度，一般最高65度。第三，延伸时间，常用延伸温度72度，延伸时间根据你的系列长短决定

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4楼2017-08-10 16:59:39
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ghst110

银虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by chiden at 2017-08-10 10:57:39
首先，你可以先试试用高保真酶扩增，一种不行，换一种再试试，好多高GC含量的片段也能拿到的，不同的高保真酶的延伸温度和效率是有不同的，你需要参照所用的酶的说明。
例如：你用的takara的高保真酶KOD，它的延伸 ...

KOD是东洋纺的。。。。
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*才随遇长，识以穷精*
5楼2017-08-22 11:32:18
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