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mulinxz

新虫 (小有名气)

[求助] PCR扩增的条件设计,求助!已有1人参与

我做微生物的,我有一株菌株的质粒进行全测序了,我要扩增里面的一个基因,引物设计好了,由于要扩这基因的全长,引物并不是那么的完美,现在怎么设计pcr反应条件,模板gc含量0.65,怎么办?我这个学渣不知道怎么办了,求大神帮助!!!

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幻影望晴

新虫 (初入文坛)

第一,买高保真酶,建议takara家的,也可以是Vazyme,根据说明书设置首先,进行退火温度梯度筛选,

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3楼2017-08-10 16:54:13
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chiden

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
首先,你可以先试试用高保真酶扩增,一种不行,换一种再试试,好多高GC含量的片段也能拿到的,不同的高保真酶的延伸温度和效率是有不同的,你需要参照所用的酶的说明。
例如:你用的takara的高保真酶KOD,它的延伸温度就是68℃,好多其他的酶是72℃。几乎大多高保真酶的延伸效率都很好,30s/1kb。也有更快的,这里就不细讲了,要看酶的说明书!!!
具体条件,说明书上一般会给出一个参考模板,根据这个模板可以自行调整,直至拿到目的片段为止。
希望对你能有所帮助
即使难过,也要微笑着走下去
2楼2017-08-10 10:57:39
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幻影望晴

新虫 (初入文坛)

手残 按了发送请原谅,继续哈!第二,退火温度选择,一般设计引物的Tm值为60以上,根据实际情况,从引物低5度开始设置梯度,间隔2度,一般最高65度。第三,延伸时间,常用延伸温度72度,延伸时间根据你的系列长短决定

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4楼2017-08-10 16:59:39
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ghst110

银虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by chiden at 2017-08-10 10:57:39
首先,你可以先试试用高保真酶扩增,一种不行,换一种再试试,好多高GC含量的片段也能拿到的,不同的高保真酶的延伸温度和效率是有不同的,你需要参照所用的酶的说明。
例如:你用的takara的高保真酶KOD,它的延伸 ...

KOD是东洋纺的。。。。
*才随遇长,识以穷精*
5楼2017-08-22 11:32:18
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