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求助！用高保真酶PCR，无条带却胶孔亮是怎么回事？急！ 已有3人参与
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用的拟南芥cDNA做的PCR，目标条带2400bp，之前是用Taq酶可以p出来，做的退火温度梯度，发现56度最合适（图1第二泳道），之后就用高保真pfu做，50ul体系:模板1ul，上下引物各1ul，pfu酶 1ul，buffer 10ul，dNTP 4ul，ddH2O 32ul. 程序按全式金pfu说明书来的:95°5:00，95°20s，56°20s，72°1:30，37个循环，72°5:00。琼脂糖胶配的是1.2％，也换了新电泳液，然而还是跑不出来（图二）maker都是5000bp……重复好多次都是这样。请问有没有可能是模板浓度太高了？需要稀释多少倍？还是引物有问题？挺急的，谢谢各位大神啦！  发自小木虫Android客户端 |
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zhouxfd
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2楼2017-07-20 08:33:17
bbqlhb
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3楼2017-07-20 08:40:18
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高保真聚合酶相比于普通聚合酶对模板温度等条件要严格，条件要多摸索一下。也可以使用全式金的那种混合酶TA克隆，再链接一个TA载体用于测序以及目的片段的获得 发自小木虫Android客户端 |
10楼2017-07-24 01:15:10
13楼2017-07-29 20:04:29
4楼2017-07-20 10:22:30
5楼2017-07-20 10:24:55
6楼2017-07-20 20:38:55
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今天的实验模板已经稀释了5倍，现在浓度是47ng／ul，可以看到胶孔已经没有昨天亮了，但是泳道依旧很亮，可以看到有浅浅的目标条带（第四泳道），做了个退火梯度，依次是56,54,54,53，我的体系是25ul的，分别是模板0.5ul，上下引物各0.5ul，buffer 2.5ul，dNTP 2ul，Taq酶 0.5ul，ddH2O 18.5ul， 程序是95°4min，95°30s，53~56°30s，72°2min40s，35个循环，72°10min，用得是泽星的taq酶，胶浓度1.0%，是否是引物特异性不好，需要重新设引物吗？  发自小木虫Android客户端 |
7楼2017-07-20 21:31:18
8楼2017-07-21 12:01:18
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我觉得也是引物的问题了，昨天反转录了RNA，今天把cDNA稀释了三个浓度梯度，又换了新酶，降低了循环数，还做了退火温度的梯度，依旧全是通亮的弥散带。也许是引物被污染了，我又重新设了两组新引物，明天送到。再做做看。 发自小木虫Android客户端 |
9楼2017-07-24 00:23:32