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麻团小学霸

新虫 (初入文坛)

[求助] 求助!用高保真酶PCR,无条带却胶孔亮是怎么回事?急! 已有3人参与

用的拟南芥cDNA做的PCR,目标条带2400bp,之前是用Taq酶可以p出来,做的退火温度梯度,发现56度最合适(图1第二泳道),之后就用高保真pfu做,50ul体系:模板1ul,上下引物各1ul,pfu酶 1ul,buffer 10ul,dNTP 4ul,ddH2O 32ul.  程序按全式金pfu说明书来的:95°5:00,95°20s,56°20s,72°1:30,37个循环,72°5:00。琼脂糖胶配的是1.2%,也换了新电泳液,然而还是跑不出来(图二)maker都是5000bp……重复好多次都是这样。请问有没有可能是模板浓度太高了?需要稀释多少倍?还是引物有问题?挺急的,谢谢各位大神啦!

求助!用高保真酶PCR,无条带却胶孔亮是怎么回事?急!


求助!用高保真酶PCR,无条带却胶孔亮是怎么回事?急!-1


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麻团小学霸

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by bbqlhb at 2017-07-20 08:40:18
没有P出来,那是杂质造成的拖带。。。

是cDNA不纯吗?我是否要重提RNA,不过目前我没有植物材料了,这是从其他实验室借的拟南芥cDNA

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4楼2017-07-20 10:22:30
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zhouxfd

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-07-24 07:45:08
看起来可能pfu扩不了那么长吧,能不能换个酶,比如KOD 或 Q5
2楼2017-07-20 08:33:17
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bbqlhb

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
没有P出来,那是杂质造成的拖带。。。
3楼2017-07-20 08:40:18
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麻团小学霸

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by zhouxfd at 2017-07-20 08:33:17
看起来可能pfu扩不了那么长吧,能不能换个酶,比如KOD 或 Q5

谢谢

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5楼2017-07-20 10:24:55
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