| 查看: 3545 | 回复: 15 | ||
[求助]
求助！用高保真酶PCR，无条带却胶孔亮是怎么回事？急！ 已有3人参与
|
||
用的拟南芥cDNA做的PCR，目标条带2400bp，之前是用Taq酶可以p出来，做的退火温度梯度，发现56度最合适（图1第二泳道），之后就用高保真pfu做，50ul体系:模板1ul，上下引物各1ul，pfu酶 1ul，buffer 10ul，dNTP 4ul，ddH2O 32ul. 程序按全式金pfu说明书来的:95°5:00，95°20s，56°20s，72°1:30，37个循环，72°5:00。琼脂糖胶配的是1.2％，也换了新电泳液，然而还是跑不出来（图二）maker都是5000bp……重复好多次都是这样。请问有没有可能是模板浓度太高了？需要稀释多少倍？还是引物有问题？挺急的，谢谢各位大神啦！  发自小木虫Android客户端 |
回复此楼» 猜你喜欢
留学--博士招生
已经有16人回复
-
化学工程，本211，求调剂，ab区不限
已经有4人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有115人回复
-
湖北师范大学招调剂啦
已经有9人回复
-
邵阳学院食品与化学工程学院硕士调剂
已经有0人回复
-
天津商业大学 生物与医药课题组招生
已经有0人回复
-
生物化工学硕招收调剂
已经有0人回复
-
广东石油化工学院2026年硕士研究生需要多名生物，制药工程，食品专业的调剂生
已经有0人回复
-
317分 一志愿江南大学 化学工程学硕 求调剂
已经有6人回复
-
化工申博
已经有3人回复
zhouxfd
木虫 (正式写手)
- 应助: 158 (高中生)
- 金币: 4721.3
- 散金: 73
- 红花: 22
- 帖子: 697
- 在线: 72.8小时
- 虫号: 1427827
- 注册: 2011-10-05
- 性别: GG
- 专业: 微生物生理与生物化学
2楼2017-07-20 08:33:17
bbqlhb
木虫 (小有名气)
- 应助: 70 (初中生)
- 金币: 1818.6
- 红花: 11
- 帖子: 267
- 在线: 127.3小时
- 虫号: 3365870
- 注册: 2014-08-14
- 专业: 生物大分子结构与功能
3楼2017-07-20 08:40:18
|
高保真聚合酶相比于普通聚合酶对模板温度等条件要严格，条件要多摸索一下。也可以使用全式金的那种混合酶TA克隆，再链接一个TA载体用于测序以及目的片段的获得 发自小木虫Android客户端 |
10楼2017-07-24 01:15:10
13楼2017-07-29 20:04:29
4楼2017-07-20 10:22:30
5楼2017-07-20 10:24:55
6楼2017-07-20 20:38:55
|
今天的实验模板已经稀释了5倍，现在浓度是47ng／ul，可以看到胶孔已经没有昨天亮了，但是泳道依旧很亮，可以看到有浅浅的目标条带（第四泳道），做了个退火梯度，依次是56,54,54,53，我的体系是25ul的，分别是模板0.5ul，上下引物各0.5ul，buffer 2.5ul，dNTP 2ul，Taq酶 0.5ul，ddH2O 18.5ul， 程序是95°4min，95°30s，53~56°30s，72°2min40s，35个循环，72°10min，用得是泽星的taq酶，胶浓度1.0%，是否是引物特异性不好，需要重新设引物吗？  发自小木虫Android客户端 |
7楼2017-07-20 21:31:18
8楼2017-07-21 12:01:18
|
我觉得也是引物的问题了，昨天反转录了RNA，今天把cDNA稀释了三个浓度梯度，又换了新酶，降低了循环数，还做了退火温度的梯度，依旧全是通亮的弥散带。也许是引物被污染了，我又重新设了两组新引物，明天送到。再做做看。 发自小木虫Android客户端 |
9楼2017-07-24 00:23:32
