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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 求助！用高保真酶PCR，无条带却胶孔亮是怎么回事？急！
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麻团小学霸

新虫 (初入文坛)

[求助] 求助！用高保真酶PCR，无条带却胶孔亮是怎么回事？急！ 已有3人参与

用的拟南芥cDNA做的PCR，目标条带2400bp，之前是用Taq酶可以p出来，做的退火温度梯度，发现56度最合适（图1第二泳道），之后就用高保真pfu做，50ul体系:模板1ul，上下引物各1ul，pfu酶 1ul，buffer 10ul，dNTP 4ul，ddH2O 32ul.  程序按全式金pfu说明书来的:95°5:00，95°20s，56°20s，72°1:30，37个循环，72°5:00。琼脂糖胶配的是1.2％，也换了新电泳液，然而还是跑不出来（图二）maker都是5000bp……重复好多次都是这样。请问有没有可能是模板浓度太高了？需要稀释多少倍？还是引物有问题？挺急的，谢谢各位大神啦！

求助！用高保真酶PCR，无条带却胶孔亮是怎么回事？急！


求助！用高保真酶PCR，无条带却胶孔亮是怎么回事？急！-1


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1楼 2017-07-19 22:01:00
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ivirus

金虫 (正式写手)
高保真聚合酶相比于普通聚合酶对模板温度等条件要严格，条件要多摸索一下。也可以使用全式金的那种混合酶TA克隆，再链接一个TA载体用于测序以及目的片段的获得

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奔三的年纪 想换个环境
10楼2017-07-24 01:15:10
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zhouxfd

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-07-24 07:45:08
看起来可能pfu扩不了那么长吧，能不能换个酶，比如KOD 或 Q5
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2楼2017-07-20 08:33:17
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bbqlhb

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
没有P出来，那是杂质造成的拖带。。。
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3楼2017-07-20 08:40:18
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麻团小学霸

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by bbqlhb at 2017-07-20 08:40:18
没有P出来，那是杂质造成的拖带。。。

是cDNA不纯吗？我是否要重提RNA，不过目前我没有植物材料了，这是从其他实验室借的拟南芥cDNA

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4楼2017-07-20 10:22:30
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