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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 点突变PCR整个质粒无目的条带
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smile1991_26

新虫 (初入文坛)

[求助] 点突变PCR整个质粒无目的条带 已有3人参与

点突变PCR一整个质粒，买的质粒冻干粉，质粒大小8K，按照说明书溶解后，换了各种退火温度，用了两种酶，一种酶PCR后均出现抹带，另一种酶出现特别明显的引物二聚体，P了一个星期了，挺急的，引物设计完全没错

点突变PCR整个质粒无目的条带


点突变PCR整个质粒无目的条带-1


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1楼 2017-05-28 20:59:18
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kangaroo0513

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-05-29 08:28:25
超过5k的一般都不太容易P的成功，少数酶可能能搞定。但是我做点突变都是局部突变之后连回去的，这样测序局部就可以了。否则别的地方有错你都不知道。如果你还做不出，就考虑外包给我做算了。
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3楼2017-05-28 22:23:12
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伤何处

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-05-29 08:28:53
你用的什么方法点突变的？是设计两对引物做overlapping PCR还是说结合DpnI 酶处理？或者其他方法。
我现在都用TypeIIS 限制性内切酶（例如BpiI，BsaI）来做点突变。单个位点点突的话，就设计两对引物（点突位置引物5‘端带酶切位点及点突位点）分别扩增，然后酶切酶连就可以。
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对也罢，错也罢；正也罢，逆也罢；通途也好，崎岖无妨……但问，吾心坚否？若坚，纵使歧路，以铁心，贯穿而过，亦为大道！不坚，便是坦途，也难登临绝顶，观险峰
5楼2017-05-29 00:51:36
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smile1991_26

新虫 (初入文坛)
酶和dNTP都是全新的…引物也是新合成的

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2楼2017-05-28 21:01:13
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smile1991_26

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by kangaroo0513 at 2017-05-28 22:23:12
超过5k的一般都不太容易P的成功，少数酶可能能搞定。但是我做点突变都是局部突变之后连回去的，这样测序局部就可以了。否则别的地方有错你都不知道。如果你还做不出，就考虑外包给我做算了。

怎么局部突变呢……

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4楼2017-05-28 22:55:40
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smile1991_26

新虫 (初入文坛)
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5楼: Originally posted by 伤何处 at 2017-05-29 00:51:36
你用的什么方法点突变的？是设计两对引物做overlapping PCR还是说结合DpnI 酶处理？或者其他方法。
我现在都用TypeIIS 限制性内切酶（例如BpiI，BsaI）来做点突变。单个位点点突的话，就设计两对引物（点突位置引物 ...

我是用DpnI酶处理…

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6楼2017-05-29 08:05:10
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伤何处

木虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by smile1991_26 at 2017-05-29 08:05:10
我是用DpnI酶处理…
...

所以你应该是用一对引物朝两个方向扩增整个质粒，回收PCR产物，然后用DpnI切掉原始质粒模板，再让扩增产物末端相连 转化大肠杆菌？
DpnI 我只用过Vazyme的Mut Express II Fast Mutagenesis Kit V2试剂盒，不知道你是不是这样的步骤。
看你的电泳条带，第一张图扩出来的片段都很小，第二张图没明显条带。
你试下用高保真的酶，然后模板尽量少加（少于10ng），再PCR一下试试。
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对也罢，错也罢；正也罢，逆也罢；通途也好，崎岖无妨……但问，吾心坚否？若坚，纵使歧路，以铁心，贯穿而过，亦为大道！不坚，便是坦途，也难登临绝顶，观险峰
7楼2017-05-29 18:51:23
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smile1991_26

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 伤何处 at 2017-05-29 18:51:23
所以你应该是用一对引物朝两个方向扩增整个质粒，回收PCR产物，然后用DpnI切掉原始质粒模板，再让扩增产物末端相连 转化大肠杆菌？
DpnI 我只用过Vazyme的Mut Express II Fast Mutagenesis Kit V2试剂盒，不知道你 ...

是这样子的，我的粉末质粒溶解完是76.3ng/ul，分别稀释了50倍和100倍P不出来，下面是质粒跑的电泳也没问题啊……他们都说点突这个特别好P，随便一P就P出来了，我简直崩溃了……不知道问题在哪，引物出了这么明显的二聚体，应该也没降解吧……
点突变PCR整个质粒无目的条带-2



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8楼2017-05-29 21:33:56
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jcstone1027

铁杆木虫 (正式写手)

木虫

【答案】应助回帖

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我今天也在做这个，这个点突变扩不出来还是有可能的，我扩出来了，浓度非常低，也不能用，因为有退火温度还有引物特异性的原因。
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9楼2017-05-29 22:29:43
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伤何处

木虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by smile1991_26 at 2017-05-29 21:33:56
是这样子的，我的粉末质粒溶解完是76.3ng/ul，分别稀释了50倍和100倍P不出来，下面是质粒跑的电泳也没问题啊……他们都说点突这个特别好P，随便一P就P出来了，我简直崩溃了……不知道问题在哪，引物出了这么明显的 ...

一般拿质粒做模板来做PCR确实很好扩的。。。而且对引物的要求很低。我觉得你最好再确认下引物有没有错，例如扩增方向....（虽然你说引物完全没问题）
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对也罢，错也罢；正也罢，逆也罢；通途也好，崎岖无妨……但问，吾心坚否？若坚，纵使歧路，以铁心，贯穿而过，亦为大道！不坚，便是坦途，也难登临绝顶，观险峰
10楼2017-05-29 22:38:30
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