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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 点突变PCR整个质粒无目的条带
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smile1991_26

新虫 (初入文坛)

[求助] 点突变PCR整个质粒无目的条带 已有3人参与

点突变PCR一整个质粒，买的质粒冻干粉，质粒大小8K，按照说明书溶解后，换了各种退火温度，用了两种酶，一种酶PCR后均出现抹带，另一种酶出现特别明显的引物二聚体，P了一个星期了，挺急的，引物设计完全没错

点突变PCR整个质粒无目的条带


点突变PCR整个质粒无目的条带-1


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1楼 2017-05-28 20:59:18
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jcstone1027

铁杆木虫 (正式写手)

木虫

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我今天也在做这个，这个点突变扩不出来还是有可能的，我扩出来了，浓度非常低，也不能用，因为有退火温度还有引物特异性的原因。
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学习，交流
9楼2017-05-29 22:29:43
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smile1991_26

新虫 (初入文坛)
酶和dNTP都是全新的…引物也是新合成的

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2楼2017-05-28 21:01:13
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kangaroo0513

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-05-29 08:28:25
超过5k的一般都不太容易P的成功，少数酶可能能搞定。但是我做点突变都是局部突变之后连回去的，这样测序局部就可以了。否则别的地方有错你都不知道。如果你还做不出，就考虑外包给我做算了。
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3楼2017-05-28 22:23:12
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smile1991_26

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by kangaroo0513 at 2017-05-28 22:23:12
超过5k的一般都不太容易P的成功，少数酶可能能搞定。但是我做点突变都是局部突变之后连回去的，这样测序局部就可以了。否则别的地方有错你都不知道。如果你还做不出，就考虑外包给我做算了。

怎么局部突变呢……

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4楼2017-05-28 22:55:40
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