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smile1991_26

新虫 (初入文坛)

[求助] 点突变PCR整个质粒无目的条带已有3人参与

点突变PCR一整个质粒,买的质粒冻干粉,质粒大小8K,按照说明书溶解后,换了各种退火温度,用了两种酶,一种酶PCR后均出现抹带,另一种酶出现特别明显的引物二聚体,P了一个星期了,挺急的,引物设计完全没错

点突变PCR整个质粒无目的条带


点突变PCR整个质粒无目的条带-1


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伤何处

木虫 (正式写手)

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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-05-29 08:28:53
你用的什么方法点突变的?是设计两对引物做overlapping PCR还是说结合DpnI 酶处理?或者其他方法。
我现在都用TypeIIS 限制性内切酶(例如BpiI,BsaI)来做点突变。单个位点点突的话,就设计两对引物(点突位置引物5‘端带酶切位点及点突位点)分别扩增,然后酶切酶连就可以。
对也罢,错也罢;正也罢,逆也罢;通途也好,崎岖无妨……但问,吾心坚否?若坚,纵使歧路,以铁心,贯穿而过,亦为大道!不坚,便是坦途,也难登临绝顶,观险峰
5楼2017-05-29 00:51:36
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smile1991_26

新虫 (初入文坛)

酶和dNTP都是全新的…引物也是新合成的

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2楼2017-05-28 21:01:13
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kangaroo0513

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-05-29 08:28:25
超过5k的一般都不太容易P的成功,少数酶可能能搞定。但是我做点突变都是局部突变之后连回去的,这样测序局部就可以了。否则别的地方有错你都不知道。如果你还做不出,就考虑外包给我做算了。
3楼2017-05-28 22:23:12
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smile1991_26

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by kangaroo0513 at 2017-05-28 22:23:12
超过5k的一般都不太容易P的成功,少数酶可能能搞定。但是我做点突变都是局部突变之后连回去的,这样测序局部就可以了。否则别的地方有错你都不知道。如果你还做不出,就考虑外包给我做算了。

怎么局部突变呢……

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4楼2017-05-28 22:55:40
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