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smile1991_26

新虫 (初入文坛)

[求助] 点突变PCR整个质粒无目的条带已有3人参与

点突变PCR一整个质粒,买的质粒冻干粉,质粒大小8K,按照说明书溶解后,换了各种退火温度,用了两种酶,一种酶PCR后均出现抹带,另一种酶出现特别明显的引物二聚体,P了一个星期了,挺急的,引物设计完全没错

点突变PCR整个质粒无目的条带


点突变PCR整个质粒无目的条带-1


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smile1991_26

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
7楼: Originally posted by 伤何处 at 2017-05-29 18:51:23
所以你应该是用一对引物朝两个方向扩增整个质粒,回收PCR产物,然后用DpnI切掉原始质粒模板,再让扩增产物末端相连 转化大肠杆菌?
DpnI 我只用过Vazyme的Mut Express II Fast Mutagenesis Kit V2试剂盒,不知道你 ...

是这样子的,我的粉末质粒溶解完是76.3ng/ul,分别稀释了50倍和100倍P不出来,下面是质粒跑的电泳也没问题啊……他们都说点突这个特别好P,随便一P就P出来了,我简直崩溃了……不知道问题在哪,引物出了这么明显的二聚体,应该也没降解吧……
点突变PCR整个质粒无目的条带-2



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8楼2017-05-29 21:33:56
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smile1991_26

新虫 (初入文坛)

酶和dNTP都是全新的…引物也是新合成的

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2楼2017-05-28 21:01:13
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kangaroo0513

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-05-29 08:28:25
超过5k的一般都不太容易P的成功,少数酶可能能搞定。但是我做点突变都是局部突变之后连回去的,这样测序局部就可以了。否则别的地方有错你都不知道。如果你还做不出,就考虑外包给我做算了。
3楼2017-05-28 22:23:12
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smile1991_26

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by kangaroo0513 at 2017-05-28 22:23:12
超过5k的一般都不太容易P的成功,少数酶可能能搞定。但是我做点突变都是局部突变之后连回去的,这样测序局部就可以了。否则别的地方有错你都不知道。如果你还做不出,就考虑外包给我做算了。

怎么局部突变呢……

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4楼2017-05-28 22:55:40
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