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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 大片段基因连接，转化问题
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mmqlhy

新虫 (初入文坛)

[求助] 大片段基因连接，转化问题 已有4人参与

我想把一个6.5kb的片段倒入4.7kb的载体中，insert 是从一个质粒上切下来的，保证有相同的酶切位点，连接体系试过1:1，2:1, 3:1，热激，都不成功，已经做了快俩月了，求大神帮忙！

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1楼 2017-03-22 21:47:11
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

小冀-

版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
可能没连上吧，我们大片段做的时候摩尔浓度一般用5:1或者10:1，多得是片段，片段比较大的不太好连
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···
7楼2017-03-23 09:01:17
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borrysa

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by mmqlhy at 2017-03-23 02:42:13
之前试过电转，做过阳性对照，转化效率没有热转高，大部分情况是板子上什么也没长
...

试试减少载体的量，加CIAP 处理。
试试5:1体系，连接过夜。

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8楼2017-03-23 09:08:32
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kangaroo0513

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
用无缝克隆吧。。。方便，假阳性率很低。
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11楼2017-03-23 10:59:20
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小冀-

版主 (著名写手)

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引用回帖:
12楼: Originally posted by 时光、过客 at 2017-03-23 11:38:28
请问摩尔浓度比例具体怎么算？需要算上片段大小吗？
...

你先看看这个吧https://wenku.baidu.com/view/f6a0f8c390c69ec3d5bb75e6
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···
13楼2017-03-23 14:40:16
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秉秉的法兰西

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by mmqlhy at 2017-03-23 01:40:12
有过两次假阳性，其余几次都是不长菌
...

我之前连过六千多的片段。我当时的载体是八千多，也是连了好久连不上，后来在片段中间找了个酶切位点，切下来。相当于三个东西一起连。终于做出来了。按照这个方法。一口气做出来四个这种克隆。你这个可以把比例换过来试试啊，毕竟你是片段大于载体。还有感受态的转化效率要高啊。

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14楼2017-03-23 15:06:10
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普通回帖

秉秉的法兰西

新虫 (小有名气)
怎么个不成功法？

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2楼2017-03-22 23:44:45
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秉秉的法兰西

新虫 (小有名气)
是不长菌，还是都是假阳性？

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3楼2017-03-22 23:45:21
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mmqlhy

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 秉秉的法兰西 at 2017-03-22 23:44:45
怎么个不成功法？

有过两次假阳性，其余几次都是不长菌

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4楼2017-03-23 01:40:12
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borrysa

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-03-23 07:45:39
试试电转？电转化效率不是一般的高。不成功是板上没长还是都长空载？

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5楼2017-03-23 01:44:54
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mmqlhy

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by borrysa at 2017-03-23 01:44:54
试试电转？电转化效率不是一般的高。不成功是板上没长还是都长空载？

之前试过电转，做过阳性对照，转化效率没有热转高，大部分情况是板子上什么也没长

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6楼2017-03-23 02:42:13
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mmqlhy

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by borrysa at 2017-03-23 09:08:32
试试减少载体的量，加CIAP 处理。
试试5:1体系，连接过夜。
...

载体自连还是比较少的，阴性对照板上只有4个菌落，我一直以为大片段连接在1:1到3:1，主要我的插入片段比载体大

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9楼2017-03-23 10:36:12
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mmqlhy

新虫 (初入文坛)
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7楼: Originally posted by 小冀- at 2017-03-23 09:01:17
可能没连上吧，我们大片段做的时候摩尔浓度一般用5:1或者10:1，多得是片段，片段比较大的不太好连

应该就是没连上，纠结的已经对实验失去兴趣了

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10楼2017-03-23 10:37:21
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