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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 层析/纯化 » 蛋白从-20℃拿出来，有沉淀
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杨武哥

新虫 (初入文坛)

[求助] 蛋白从-20℃拿出来，有沉淀 已有2人参与

纯化后蛋白保存在负20℃，拿出来解冻后有沉淀出现，离心后测蛋白含量，很低啊！怎么提高其溶解度减少析出？
蛋白新手，跪求

@gyesang 发自小木虫Android客户端
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1楼 2016-12-29 10:47:40
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白玉子双

金虫 (小有名气)
最好保存负80。这样几个月都没问题。

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独立做自己
6楼2016-12-29 15:40:07
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十四_14

荣誉版主 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
杨武哥: 金币+2 2016-12-29 20:07:00
纯化后的蛋白不要直接冻到冰箱中  首先  既然你是镍柱纯化  那么是用咪唑洗脱的吧？不知道你的咪唑浓度  但纯化后的蛋白溶液最好利用超滤换液除掉咪唑  以防对蛋白造成影响
其次  换液后蛋白可以加入甘油或者蔗糖后冻存  但即便是加了保护剂  也不要反复冻融  可以分装成几管

DTT主要是对含有二硫键的蛋白来说  可以保护其中的二硫键的还原态
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4楼2016-12-29 15:18:43
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咸花生

木虫 (正式写手)
DDT是防止二硫键氧化，上面要你加甘油的，你要考虑会不会影响你下一步实验。蛋白质的稳定性和结构有关，一般认为全程4℃或者冰上是稳妥的，冻冰箱可以，常规做法液氮加超低温冰箱

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5楼2016-12-29 15:34:17
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雨中静

铜虫 (初入文坛)
除了上面各位说的问题,你还需要考虑下PH值。

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7楼2016-12-29 15:50:25
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云烟渺渺

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
杨武哥: 金币+2, ★★★很有帮助 2016-12-29 20:06:28
没有做冻融实验就把蛋白冻存了吗？
可以尝试加10%的甘油和1-2mM EDTA，蛋白最好还是保存在-80摄氏度，如果要反复拿出来用就分装几管，反复冻融对蛋白不利，看你的描述不是蛋白析出了，是蛋白沉淀了。
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2楼2016-12-29 12:02:17
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杨武哥

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 云烟渺渺 at 2016-12-29 12:02:17
没有做冻融实验就把蛋白冻存了吗？
可以尝试加10%的甘油和1-2mM EDTA，蛋白最好还是保存在-80摄氏度，如果要反复拿出来用就分装几管，反复冻融对蛋白不利，看你的描述不是蛋白析出了，是蛋白沉淀了。

没有做，这个第一次做，不懂怎么保存就直接过镍柱后，全部保存到低温冰箱了。
我试试添加甘油和EDTA。添加甘油的作用我在网上看到，说是因为其粘度大可以防止结构的改变，那么edta呢？
还有人说加DTT，这是什么作用？

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3楼2016-12-29 14:59:40
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十四_14

荣誉版主 (正式写手)

【答案】应助回帖

恩  楼上咸花生说的对  加保护剂是必要的  但楼主要考虑这种保护剂会不会影响后续实验  像我之前做的蛋白  因为后续要做Biacore  甘油会影响结果  所以做之前就要超滤换液把甘油除掉  但是甘油本身超滤的时候比较慢  建议用蔗糖好一点
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8楼2016-12-29 15:55:56
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杨武哥

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 十四_14 at 2016-12-29 15:55:56
恩  楼上咸花生说的对  加保护剂是必要的  但楼主要考虑这种保护剂会不会影响后续实验  像我之前做的蛋白  因为后续要做Biacore  甘油会影响结果  所以做之前就要超滤换液把甘油除掉  但是甘油本身超滤的时候比较慢 ...

如果添加蔗糖，添加的量呢？

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9楼2016-12-29 16:08:53
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杨武哥

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 十四_14 at 2016-12-29 15:55:56
恩  楼上咸花生说的对  加保护剂是必要的  但楼主要考虑这种保护剂会不会影响后续实验  像我之前做的蛋白  因为后续要做Biacore  甘油会影响结果  所以做之前就要超滤换液把甘油除掉  但是甘油本身超滤的时候比较慢 ...

我做一个细菌抑制实验，可能还要上动物细胞，加什么合适？加入的量呢？

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10楼2016-12-29 16:19:57
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