24小时热门版块排行榜

返回列表

【奖励】本帖被评价2次，作者Allanflying增加金币 1 个

Allanflying

金虫 (小有名气)

应助: 0 (幼儿园)
金币: 604.3
帖子: 62
在线: 100小时
虫号: 866997

[资源] DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Germany)试剂盒中文操作说明书

一．利用DNeasy® Blood & Tissue试剂盒提取样本总DNA
1．前处理：
注意：
1）石蜡包埋组织的DNA一般小于650bp，还要视样本类型与保存年限而定。
2）固定剂一般为福尔马林或酒精。不推荐用蛾酸固定的样本。
3）溶解时间随样本类型和溶解状态而定。
4）产量视样本类型和保存年限而定。推荐用50-100ul的AE缓冲液洗脱纯化的DNA。
5）开始前要预热孵化器或水浴锅至37℃，用于操作步骤9）。

1.石蜡包埋组织的前处理
操作步骤：
1）将小片石蜡包埋的组织（小于25mg）放入2ml离心管中（自备）。
2）加入1200ul的二甲苯，用力涡旋震荡。
3）最大转速室温（15-25°）离心5分钟。
4）移液枪吸去上清。小心不要吸去沉淀。
5）往沉淀中加1200ul的（96-100%）酒精（目的是洗去剩余二甲苯），轻柔地震荡。
6）最大转速室温（15-25°）离心5分钟。
7）移液枪吸去上清。小心不要吸去沉淀。
8）重复一次步骤5-7。
9） 37°孵育10-15分钟，孵育过程打开离心管盖，直到酒精蒸发干净。
10）加入180ul的ATL缓冲液，继续提取组织总DNA中的步骤2。

2．福尔马林组织的前处理
操作步骤：
1）用PBS润洗组织样本（小于25mg）两次（目的是去除固定剂）。
2）去PBS，继续提取组织总DNA中的步骤1.

2．动物组织总DNA的提取
注意：
1） ATL缓冲液和AL缓冲液可能存储后沉淀，如果沉淀，在56°孵育直至沉淀溶解。
2）在AW1缓冲液和AW2缓冲液中加入一定量（见瓶身）的（96%-100%）酒精，然后才使用。
3）打开水浴锅至56℃，用于步骤2。
4）如果是冻存的样本，拿出来室温预热，避免反复冻融。

操作步骤：
1）取25mg组织，切成小块，放入1.5ml的离心管中。加入180ul的Buffer ATL。
2）加入20ul的蛋白酶K。涡旋震荡（5-10S）。56℃孵育直至组织消化完全，一般为1-3小时。偶尔间断的拿出震荡。
3）涡旋震荡15S，加入200ul的Buffer AL,涡旋充分混匀。加入200ul的（96%-100%）的酒精。涡旋充分混匀。（注：样多时可将AL和酒精预混以节省时间）
4）转移步骤3中的所有混合液至DNeasy Mini spin离心柱，柱子放在2ml的收集管上（已提供），≧6000g（8000rpm）离心1分钟。弃收集管/液。
5）将离心柱放在一个新的2ml收集管上（已提供）加500ul缓冲液AW1，≧6000g（8000rpm）离心1分钟。弃收集管/液。
6）将离心柱放在一个新的2ml收集管上（已提供）。加500ul缓冲液AW2，20000g（14000rpm）离心3分钟。弃收集管/液。
7）将离心柱放在一个新的1.5或2ml离心管（自备）上，吸200ul的缓冲液AE在吸附膜上，室温1分钟，≧6000g（8000rpm）离心1分钟。
8）为增大DNA产量，重复步骤7（注意：从离心管中吸取液体反复洗脱）。

3．动物血液或细胞中提取DNA
1）取50-100ul的抗凝血至1.5ml或2ml离心管中（自备），加20ul蛋白酶K，用PBS补加至220ul。
2) 加入200ul缓冲液AL，涡旋震荡充分混匀，56℃孵育10min。
3）加入200ul的（96%-100%）酒精，涡旋震荡充分混匀。
4）移取步骤3的混合液至离心柱上，离心柱放在2ml收集管上（已提供）。≧6000g（8000rpm）离心1分钟。弃收集管/液。
5）离心柱放至新的2ml收集管上（已提供），加500ul的缓冲液AW1，≧6000g（8000rpm）离心1分钟。弃收集管/液。
6）离心柱放至新的2ml收集管上（已提供），加500ul的缓冲液AW2，20000g（14000rpm）离心3分钟。弃收集管/液。
7）将离心柱放在一个新的1.5或2ml收集管（自备）上，吸200ul的缓冲液AE在吸附膜上，室温1分钟，≧6000g（8000rpm）离心1分钟。
8）为增大DNA产量，重复步骤7（注意：从离心管中吸取液体反复洗脱）。

回复此楼