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DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Germany)试剂盒中文操作说明书
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一．利用DNeasy® Blood & Tissue试剂盒提取样本总DNA 1．前处理： 注意： 1） 石蜡包埋组织的DNA一般小于650bp，还要视样本类型与保存年限而定。 2） 固定剂一般为福尔马林或酒精。不推荐用蛾酸固定的样本。 3） 溶解时间随样本类型和溶解状态而定。 4） 产量视样本类型和保存年限而定。推荐用50-100ul的AE缓冲液洗脱纯化的DNA。 5） 开始前要预热孵化器或水浴锅至37℃，用于操作步骤9）。 1.石蜡包埋组织的前处理 操作步骤： 1） 将小片石蜡包埋的组织（小于25mg）放入2ml离心管中（自备）。 2） 加入1200ul的二甲苯，用力涡旋震荡。 3） 最大转速室温（15-25°）离心5分钟。 4） 移液枪吸去上清。小心不要吸去沉淀。 5） 往沉淀中加1200ul的（96-100%）酒精（目的是洗去剩余二甲苯），轻柔地震荡。 6） 最大转速室温（15-25°）离心5分钟。 7） 移液枪吸去上清。小心不要吸去沉淀。 8） 重复一次步骤5-7。 9） 37°孵育10-15分钟，孵育过程打开离心管盖，直到酒精蒸发干净。 10） 加入180ul的ATL缓冲液，继续提取组织总DNA中的步骤2。 2．福尔马林组织的前处理 操作步骤： 1） 用PBS润洗组织样本（小于25mg）两次（目的是去除固定剂）。 2） 去PBS，继续提取组织总DNA中的步骤1. 2．动物组织总DNA的提取 注意： 1） ATL缓冲液和AL缓冲液可能存储后沉淀，如果沉淀，在56°孵育直至沉淀溶解。 2） 在AW1缓冲液和AW2缓冲液中加入一定量（见瓶身）的（96%-100%）酒精，然后才使用。 3） 打开水浴锅至56℃，用于步骤2。 4） 如果是冻存的样本，拿出来室温预热，避免反复冻融。 操作步骤： 1） 取25mg组织，切成小块，放入1.5ml的离心管中。加入180ul的Buffer ATL。 2） 加入20ul的蛋白酶K。涡旋震荡（5-10S）。56℃孵育直至组织消化完全，一般为1-3小时。偶尔间断的拿出震荡。 3） 涡旋震荡15S，加入200ul的Buffer AL,涡旋充分混匀。加入200ul的（96%-100%）的酒精。涡旋充分混匀。（注：样多时可将AL和酒精预混以节省时间） 4） 转移步骤3中的所有混合液至DNeasy Mini spin离心柱，柱子放在2ml的收集管上（已提供），≧6000g（8000rpm）离心1分钟。弃收集管/液。 5） 将离心柱放在一个新的2ml收集管上（已提供）加500ul缓冲液AW1，≧6000g（8000rpm）离心1分钟。弃收集管/液。 6） 将离心柱放在一个新的2ml收集管上（已提供）。加500ul缓冲液AW2，20000g（14000rpm）离心3分钟。弃收集管/液。 7） 将离心柱放在一个新的1.5或2ml离心管（自备）上，吸200ul的缓冲液AE在吸附膜上，室温1分钟，≧6000g（8000rpm）离心1分钟。 8） 为增大DNA产量，重复步骤7（注意：从离心管中吸取液体反复洗脱）。 3．动物血液或细胞中提取DNA 1） 取50-100ul的抗凝血至1.5ml或2ml离心管中（自备），加20ul蛋白酶K，用PBS补加至220ul。 2) 加入200ul缓冲液AL，涡旋震荡充分混匀，56℃孵育10min。 3）加入200ul的（96%-100%）酒精，涡旋震荡充分混匀。 4）移取步骤3的混合液至离心柱上，离心柱放在2ml收集管上（已提供）。≧6000g（8000rpm）离心1分钟。弃收集管/液。 5）离心柱放至新的2ml收集管上（已提供），加500ul的缓冲液AW1，≧6000g（8000rpm）离心1分钟。弃收集管/液。 6）离心柱放至新的2ml收集管上（已提供），加500ul的缓冲液AW2，20000g（14000rpm）离心3分钟。弃收集管/液。 7）将离心柱放在一个新的1.5或2ml收集管（自备）上，吸200ul的缓冲液AE在吸附膜上，室温1分钟，≧6000g（8000rpm）离心1分钟。 8）为增大DNA产量，重复步骤7（注意：从离心管中吸取液体反复洗脱）。 |
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