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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 动植物 » 实验技术 » 大基因片段的扩增和载体构建
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山农大的80后

新虫 (初入文坛)

[交流] 大基因片段的扩增和载体构建 已有9人参与

各位同仁好，我最近想扩增一个3500bp基因片段，利用PFU跑PCR后进行胶回收，然后将胶回收产物作为模板又进行扩增，然后胶回收，利用普通Taq酶扩增后跑电泳，发现条带不是3000多bp了，连接了18-T后筛菌，条带也不够3000多。麻烦哪位老师给我指点指点，谢谢！
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1楼 2016-11-24 21:59:36
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生物狗-哈

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
多次PCR不好，容易引入突变，还可能片段丢失，建议试试诺唯赞的同源重组试剂盒，高保真酶Phanta扩增后，回收直接做重组连接，不需要额外加A了。
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8楼2016-12-28 15:45:19
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starseacow

专家顾问 (职业作家)
★
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前边两部胶回收片段大小是否正确？最后一步为什么换用Taq了？
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植物生理群69993869，为避免广告，申请加入请提供木虫昵称，院校及专业信息
2楼2016-11-25 06:34:48
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山农大的80后

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by starseacow at 2016-11-25 06:34:48
前边两部胶回收片段大小是否正确？最后一步为什么换用Taq了？

谢谢您的回复，第一次用cDNA扩增时片段大小正确，不过再拿这次胶回收产物做模板扩增时，电泳片段大小似乎就有点不对了。Pfu扩增时平末端，没法连接18-T.
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3楼2016-11-25 09:21:56
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Ailee桑卡娜

新虫 (小有名气)
★
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PCR程序设定的延伸时间加长点？我的目的片段连接T1老不长菌，好不容易长了电泳条带也不对

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4楼2016-11-25 15:47:19
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