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山农大的80后

新虫 (初入文坛)

[交流] 大基因片段的扩增和载体构建 已有9人参与

各位同仁好,我最近想扩增一个3500bp基因片段,利用PFU跑PCR后进行胶回收,然后将胶回收产物作为模板又进行扩增,然后胶回收,利用普通Taq酶扩增后跑电泳,发现条带不是3000多bp了,连接了18-T后筛菌,条带也不够3000多。麻烦哪位老师给我指点指点,谢谢!
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Ailee桑卡娜

新虫 (小有名气)


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PCR程序设定的延伸时间加长点?我的目的片段连接T1老不长菌,好不容易长了电泳条带也不对

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4楼2016-11-25 15:47:19
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生物狗-哈

新虫 (初入文坛)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
多次PCR不好,容易引入突变,还可能片段丢失,建议试试诺唯赞的同源重组试剂盒,高保真酶Phanta扩增后,回收直接做重组连接,不需要额外加A了。
8楼2016-12-28 15:45:19
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想学好的学渣

铁杆木虫 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
不一定非得用18~T啊,市面上很多平末端的载体啊。之前跑一个3500的片段,用的是南京诺唯赞的高保真,也用了全式金的几款,感觉诺唯赞效果好一些。

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9楼2016-12-28 18:39:41
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schkk

至尊木虫 (正式写手)


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18T多老的载体啊,不一定非用它,实在想用可以加尾啊

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10楼2016-12-28 22:44:02
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普通回帖

starseacow

专家顾问 (职业作家)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
前边两部胶回收片段大小是否正确?最后一步为什么换用Taq了?
植物生理群69993869,为避免广告,申请加入请提供木虫昵称,院校及专业信息
2楼2016-11-25 06:34:48
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山农大的80后

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by starseacow at 2016-11-25 06:34:48
前边两部胶回收片段大小是否正确?最后一步为什么换用Taq了?

谢谢您的回复,第一次用cDNA扩增时片段大小正确,不过再拿这次胶回收产物做模板扩增时,电泳片段大小似乎就有点不对了。Pfu扩增时平末端,没法连接18-T.
3楼2016-11-25 09:21:56
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star013

新虫 (知名作家)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
我们可以帮您做该技术哈

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5楼2016-11-25 17:36:23
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starseacow

专家顾问 (职业作家)


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引用回帖:
3楼: Originally posted by 山农大的80后 at 2016-11-25 09:21:56
谢谢您的回复,第一次用cDNA扩增时片段大小正确,不过再拿这次胶回收产物做模板扩增时,电泳片段大小似乎就有点不对了。Pfu扩增时平末端,没法连接18-T....

那就是第二次用Taq做的时候产物大小不对了?
调整一下PCR程序,Taq和Pfu应该有区别。另外就是考虑用其他合适的高保真酶
植物生理群69993869,为避免广告,申请加入请提供木虫昵称,院校及专业信息
6楼2016-11-25 17:44:41
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小牧童嘻嘻

铜虫 (初入文坛)


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引用回帖:
4楼: Originally posted by Ailee桑卡娜 at 2016-11-25 15:47:19
PCR程序设定的延伸时间加长点?我的目的片段连接T1老不长菌,好不容易长了电泳条带也不对

连接的时候也可以稍微多加一点酶,转化效果好很多
如果不知道未来是什么样的,勇敢向前走就行了
7楼2016-11-29 15:09:54
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