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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 为什么T载体总是连不上啊
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一起来旅行

银虫 (正式写手)

[求助] 为什么T载体总是连不上啊 已有6人参与

我的目的基因是1400bp左右，用的是普通的Mix扩增的，胶回收后的浓度是10.2ng/ul，用了PMD18-T和PMD19-T还有PGM-T载体，体系是cDNA5ul，Solution4ul，T-vector1ul，蓝白斑筛选后挑的都是白斑，但是菌液pcr后没有目的条带，求助各位大神啊

@biostar2009 @飞约疯人院 @wizardfan @youlinglyw 发自小木虫Android客户端
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1楼 2016-10-23 11:38:41
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

不爱做实验

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-10-23 22:18:57
保证过程中的每一步没有问题再继续
建议酶切及回收目的片段加大量，这样成功几率大
胶回收要加大回收量，并点样看回收效果
你的连接体系可以尝试目的片段：载体=3：1，并确保连接酶等未失效
最后转化时确保感受态活力
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一起来旅行
4楼2016-10-23 12:20:36
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几氧化氮

新虫 (初入文坛)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-10-23 22:19:17
确定你的PCR产 物的3’末端是否添加了一个“A”，只有加过A的产物才能连接T载体
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5楼2016-10-23 16:24:48
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一起来旅行

银虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 几氧化氮 at 2016-10-23 16:24:48
确定你的PCR产 物的3’末端是否添加了一个“A”，只有加过A的产物才能连接T载体

一般普通的mix都是加poly-A的，我用的不是高保真酶，关键是我师姐有次给我和她的一起连，然后她的成功了，我的还是连不上，我就纳闷的很啊

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7楼2016-10-23 20:50:51
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damaoouba

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
胶回收浓度好像太低了吧。。PCR产物稀释一下做模板重新P然后跑胶回收试试。
菌斑能长的话考虑是不是载体自连了。
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18楼2016-10-25 13:55:28
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普通回帖

wallee

新虫 (初入文坛)
浓度有点低啊

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2楼2016-10-23 12:04:08
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一起来旅行

银虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by wallee at 2016-10-23 12:04:08
浓度有点低啊

之前也有32ng/ul的也是连不上，都说T载体很好连的可是我都做了好多遍了就是连不上，心累啊

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3楼2016-10-23 12:20:26
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一起来旅行

银虫 (正式写手)
送红花一朵
引用回帖:
4楼: Originally posted by 不爱做实验 at 2016-10-23 12:20:36
保证过程中的每一步没有问题再继续
建议酶切及回收目的片段加大量，这样成功几率大
胶回收要加大回收量，并点样看回收效果
你的连接体系可以尝试目的片段：载体=3：1，并确保连接酶等未失效
最后转化时确保感受 ...

谢谢

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6楼2016-10-23 20:48:27
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心火天堂

金虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 一起来旅行 at 2016-10-23 20:50:51
一般普通的mix都是加poly-A的，我用的不是高保真酶，关键是我师姐有次给我和她的一起连，然后她的成功了，我的还是连不上，我就纳闷的很啊
...

有可能是操作上没有注意一些细节

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8楼2016-10-23 20:54:56
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迷路人啊

新虫 (小有名气)
连别的载体吧还是

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9楼2016-10-23 21:38:37
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小冀-

版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
应该是载体自连了吧，重新做吧，而且pcr产物回收浓度太低了
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···
10楼2016-10-24 19:05:04
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