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小蛋白SDS-PAGE 已有1人参与
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有没有人做小蛋白的啊？求教求教。。。在大肠杆菌里面融合表达了一个蛋白，目的蛋白大约3kd，融合标签20kd左右，在融合标签和目的蛋白中间引入了TEV酶切位点ENLYFQ，后面一个氨基酸是我的目的蛋白的E，纯化透析完用TEV酶切，网上很多都说TEV识别的位点是ENLYFQ’G/S，生工买的TEV酶说明书上说最后一个位点可以是任意氨基酸，然后我按照说明书上说的酶切体系，切完了跑蛋白胶，没有看到我的目的条带掉下来，不知道是因为TEV没起作用还是我的目的片段太小看不出来，网上说小分子多肽用Tricine-SDS-page做效果很好，可是我照着做的跑出来的胶压不平，很弥散，脱色完的条带集中在上半部分，下半部分的Marker还是弥散的，我在做胶时做了三层胶，但是我不知道这三层胶各应该加多少？我现在做的就是分离胶稍微比普通胶矮一些，然后加了一层1cm左右的夹层胶，上面再加一层浓缩胶，跑胶时候先用30V跑30min左右，再用100V跑完的。我的蛋白纯化用的his标签的试剂盒，但是每次纯化出来在目的条带下总有杂带。第一条和第三条是透析完的，第二条和第五条是酶切的，第四条是Marker，最小条带是6.4KDa。 2016-09-03 15 时 41 分.jpg |
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