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包晓明

新虫 (初入文坛)

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9楼: Originally posted by 千里两句 at 2016-09-03 18:23:00
透析后做的酶切吗?

对,两次透析用的不同的透析液,一次用的Tris-HCl,一次用的水,水的那次透析完的蛋白是有点乳白色的,不知道是不是变性了,变性会影响酶切吗
11楼2016-09-03 18:26:12
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千里两句

新虫 (小有名气)

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11楼: Originally posted by 包晓明 at 2016-09-03 18:26:12
对,两次透析用的不同的透析液,一次用的Tris-HCl,一次用的水,水的那次透析完的蛋白是有点乳白色的,不知道是不是变性了,变性会影响酶切吗...

不是很清楚诶,看你的描述,将透析过后的样品离心下,将pellet加上loading buffer处理后跑一下

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12楼2016-09-03 18:33:24
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千里两句

新虫 (小有名气)

如果有23左右的条带出来,那就只能说明水透析后,蛋白沉了

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13楼2016-09-03 18:34:40
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包晓明

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
12楼: Originally posted by 千里两句 at 2016-09-03 18:33:24
不是很清楚诶,看你的描述,将透析过后的样品离心下,将pellet加上loading buffer处理后跑一下
...

融合蛋白是有的,但是用TEV酶切之后看不到我的目的条带(约3KDa)掉下来,不知道是我的胶的问题还是酶切的问题
14楼2016-09-03 18:36:33
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千里两句

新虫 (小有名气)

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13楼: Originally posted by 千里两句 at 2016-09-03 18:34:40
如果有23左右的条带出来,那就只能说明水透析后,蛋白沉了

不过你透析后的样品那条道23左右有你的目的蛋白,而且量也可以

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15楼2016-09-03 18:37:27
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千里两句

新虫 (小有名气)

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14楼: Originally posted by 包晓明 at 2016-09-03 18:36:33
融合蛋白是有的,但是用TEV酶切之后看不到我的目的条带(约3KDa)掉下来,不知道是我的胶的问题还是酶切的问题...

感觉像是没有切动,不太像胶的问题

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16楼2016-09-03 18:40:02
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千里两句

新虫 (小有名气)

引用回帖:
14楼: Originally posted by 包晓明 at 2016-09-03 18:36:33
融合蛋白是有的,但是用TEV酶切之后看不到我的目的条带(约3KDa)掉下来,不知道是我的胶的问题还是酶切的问题...

感觉像是没有切动,不太像胶的问题

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17楼2016-09-03 18:40:48
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千里两句

新虫 (小有名气)

再个你的TEV跟你的融合蛋白分子量太接近了

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18楼2016-09-03 18:42:15
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包晓明

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
15楼: Originally posted by 千里两句 at 2016-09-03 18:37:27
不过你透析后的样品那条道23左右有你的目的蛋白,而且量也可以
...

我透析后的样品应该没有问题,就是纯化的蛋白有杂带,但是我的目的蛋白太小了,即使切下来我也不一定能跑出来,现在只能做一次western看看了,但是western不知道用什么胶
19楼2016-09-03 18:43:06
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千里两句

新虫 (小有名气)

你也不好区分,我觉得你还是重新跑块胶,把参照带上会好比较分析

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20楼2016-09-03 18:43:39
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