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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 试了多个条件的改变，PCR结果总是出现多条带，求助各位，谢谢。
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daylight0320

铜虫 (初入文坛)

[求助] 试了多个条件的改变，PCR结果总是出现多条带，求助各位，谢谢。 已有5人参与

目的条带1900bp，摸索改变来PCR退火温度（用的梯度PCR）,引物浓度，模板浓度，重新设计引物，结果总是有多条带，如下图（最右侧为marker）。也试了切胶回收近1900bp的条带，但是浓度达不到后续实验的要求。请问各位有什么建议吗？谢谢。

试了多个条件的改变，PCR结果总是出现多条带，求助各位，谢谢。


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1楼 2016-08-13 23:05:22
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

范威21003

铁杆木虫 (小有名气)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-08-16 22:07:23
感觉根源是在引物设计上的原因，特异性不强，引物需要进行优化，这才是关键

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7楼2016-08-14 11:46:15
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010308Jing

木虫 (正式写手)
提高退货温度呢？

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2楼2016-08-14 09:00:21
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取个什么名啊

木虫 (正式写手)
引物特异性不好，最好重新设计引物

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3楼2016-08-14 09:25:41
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daylight0320

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 010308Jing at 2016-08-14 09:00:21
提高退货温度呢？

在原来的退火温度上提高了，结果没有任何条带。

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4楼2016-08-14 11:16:01
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daylight0320

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 取个什么名啊 at 2016-08-14 09:25:41
引物特异性不好，最好重新设计引物

设计了三次引物，结果都不理想，谢谢啦

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5楼2016-08-14 11:17:32
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010308Jing

木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by daylight0320 at 2016-08-14 11:16:01
在原来的退火温度上提高了，结果没有任何条带。
...

注主要pcr看不见摸不到，只能自己不停摸索了，你后续是做亚克隆吗？

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6楼2016-08-14 11:19:24
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daylight0320

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 010308Jing at 2016-08-14 11:19:24
注主要pcr看不见摸不到，只能自己不停摸索了，你后续是做亚克隆吗？
...

对的。T克隆

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8楼2016-08-14 23:28:21
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daylight0320

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 范威21003 at 2016-08-14 11:46:15
感觉根源是在引物设计上的原因，特异性不强，引物需要进行优化，这才是关键

我再试试，不行就重设计引物啦，谢谢各位

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9楼2016-08-14 23:29:09
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hanxiaominhu

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2016-08-16 22:07:47
优化引物之前还可以试试：1，touchdown，等试试；2，多P几管最后一起回收到一管；3，用已有引物做巢式。
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10楼2016-08-15 07:44:13
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