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daylight0320

铜虫 (初入文坛)

[求助] 试了多个条件的改变,PCR结果总是出现多条带,求助各位,谢谢。 已有5人参与

目的条带1900bp,摸索改变来PCR退火温度(用的梯度PCR),引物浓度,模板浓度,重新设计引物,结果总是有多条带,如下图(最右侧为marker)。也试了切胶回收近1900bp的条带,但是浓度达不到后续实验的要求。请问各位有什么建议吗?谢谢。

试了多个条件的改变,PCR结果总是出现多条带,求助各位,谢谢。


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范威21003

铁杆木虫 (小有名气)


西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-08-16 22:07:23
感觉根源是在引物设计上的原因,特异性不强,引物需要进行优化,这才是关键

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7楼2016-08-14 11:46:15
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010308Jing

木虫 (正式写手)

2楼2016-08-14 09:00:21
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取个什么名啊

木虫 (正式写手)

引物特异性不好,最好重新设计引物

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3楼2016-08-14 09:25:41
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daylight0320

铜虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 010308Jing at 2016-08-14 09:00:21
提高退货温度呢?

在原来的退火温度上提高了,结果没有任何条带。

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4楼2016-08-14 11:16:01
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daylight0320

铜虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 取个什么名啊 at 2016-08-14 09:25:41
引物特异性不好,最好重新设计引物

设计了三次引物,结果都不理想,谢谢啦

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5楼2016-08-14 11:17:32
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010308Jing

木虫 (正式写手)

引用回帖:
4楼: Originally posted by daylight0320 at 2016-08-14 11:16:01
在原来的退火温度上提高了,结果没有任何条带。
...

注主要pcr看不见摸不到,只能自己不停摸索了,你后续是做亚克隆吗?

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6楼2016-08-14 11:19:24
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daylight0320

铜虫 (初入文坛)

引用回帖:
6楼: Originally posted by 010308Jing at 2016-08-14 11:19:24
注主要pcr看不见摸不到,只能自己不停摸索了,你后续是做亚克隆吗?
...

对的。T克隆

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8楼2016-08-14 23:28:21
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daylight0320

铜虫 (初入文坛)

引用回帖:
7楼: Originally posted by 范威21003 at 2016-08-14 11:46:15
感觉根源是在引物设计上的原因,特异性不强,引物需要进行优化,这才是关键

我再试试,不行就重设计引物啦,谢谢各位

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9楼2016-08-14 23:29:09
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hanxiaominhu

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
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西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2016-08-16 22:07:47
优化引物之前还可以试试:1,touchdown,等试试;2,多P几管最后一起回收到一管;3,用已有引物做巢式。
10楼2016-08-15 07:44:13
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