| 查看: 2182 | 回复: 9 | ||
[求助]
构建的重组菌无法诱导表达出目的蛋白 已有1人参与
|
|
求助各位一个关于蛋白表达的问题。 我有一个900bp的基因，最先是和pET28a连接，导进BL21(DE3)，一开始是表达的，但是纯化之后发现有背景蛋白，即没有诱导的菌也能表达出一个和目的片段大小相等的蛋白，但是是没有酶活的，而诱导后的蛋白是有酶活的。 后来为了去掉背景蛋白，我把这个片段和pMAL-C2X连接，导进TB1中，结果不表达了，也纯化不出任何蛋白。 于是我怀疑是pMAL-C2X这个载体有问题，就从一个先前构建可以表达的pMAL-C2X-X重组质粒中，把X去掉，把我的基因连接上去。结果还是不表达。 然后我又换了Transetta宿主，能诱导出一个MBP标签大小的蛋白，但是这个蛋白比目的蛋白小了很多，而且测序结果显示，这其中是不含突变和移码的。 后来我又把之前构建的pET28a-基因的重组质粒导进Transetta宿主菌中。结果纯化出的也是比目的蛋白小的蛋白。。。 我现在已经试过改变各种诱导条件，比如诱导时间、温度、IPTG浓度等等，但都没有显著的影响。 最后放一张我诱导表达的结果图（以重组菌TB1/C2X-目的基因为例），恳求大家给我出出主意，万分感激。 P.S：line1：marker；line2：诱导前；line3：诱导后，图中其实还有line4，就是纯化的结果，只是没有任何条带...  捕获.JPG |
回复此楼» 猜你喜欢
筑牢营养安全线：以精准检测，护健康基石
已经有0人回复
-
推荐一些20种氨基酸检测的实际应用案例
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有184人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：实验器材的 “乌龙”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：和实验材料的 “斗智斗勇”
已经有0人回复
-
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 转染实验要注意的一些问题
已经有8人回复
- 基因工程课程小结
已经有20人回复
contactljh
银虫 (小有名气)
- 应助: 1 (幼儿园)
- 金币: 50.7
- 散金: 1500
- 红花: 1
- 帖子: 73
- 在线: 74.1小时
- 虫号: 258225
- 注册: 2006-06-10
- 性别: GG
- 专业: 天然药物化学
2楼2016-06-13 15:27:30
3楼2016-06-13 16:18:45
kaobo2012
木虫 (正式写手)
- MolEPI: 1
- 应助: 100 (初中生)
- 金币: 5426.6
- 散金: 200
- 红花: 15
- 帖子: 731
- 在线: 255.3小时
- 虫号: 1168995
- 注册: 2010-12-13
- 专业: 抗体工程学
4楼2016-06-13 22:17:55
star013 
新虫 (知名作家)
- 应助: 4 (幼儿园)
- 金币: 1488.5
- 散金: 831
- 红花: 33
- 帖子: 5395
- 在线: 493.3小时
- 虫号: 1401381
- 注册: 2011-09-14
- 专业: 法学
5楼2016-06-14 09:36:06
6楼2016-06-14 14:56:55
star013
新虫 (知名作家)
- 应助: 4 (幼儿园)
- 金币: 1488.5
- 散金: 831
- 红花: 33
- 帖子: 5395
- 在线: 493.3小时
- 虫号: 1401381
- 注册: 2011-09-14
- 专业: 法学
7楼2016-06-14 15:19:24
|
本帖内容被屏蔽 |
8楼2016-06-15 21:54:35
Bioexperixgs
新虫 (正式写手)
- 应助: 13 (小学生)
- 金币: 672.9
- 散金: 337
- 红花: 8
- 帖子: 330
- 在线: 39.2小时
- 虫号: 2330746
- 注册: 2013-03-08
- 专业: 病原微生物变异与耐药
|
没有表达。你用BL21已经表达出来了，还换系统干嘛。虽然说DE3系列的菌本底表达量很少，但也不能排除没有的情况。建议你用标签抗体做WB，就能确定是不是目的蛋白，以及蛋白表达量的大概值了。 发自小木虫Android客户端 |
9楼2016-06-16 08:54:11
10楼2016-06-28 11:01:14