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构建的重组菌无法诱导表达出目的蛋白 已有1人参与
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求助各位一个关于蛋白表达的问题。 我有一个900bp的基因，最先是和pET28a连接，导进BL21(DE3)，一开始是表达的，但是纯化之后发现有背景蛋白，即没有诱导的菌也能表达出一个和目的片段大小相等的蛋白，但是是没有酶活的，而诱导后的蛋白是有酶活的。 后来为了去掉背景蛋白，我把这个片段和pMAL-C2X连接，导进TB1中，结果不表达了，也纯化不出任何蛋白。 于是我怀疑是pMAL-C2X这个载体有问题，就从一个先前构建可以表达的pMAL-C2X-X重组质粒中，把X去掉，把我的基因连接上去。结果还是不表达。 然后我又换了Transetta宿主，能诱导出一个MBP标签大小的蛋白，但是这个蛋白比目的蛋白小了很多，而且测序结果显示，这其中是不含突变和移码的。 后来我又把之前构建的pET28a-基因的重组质粒导进Transetta宿主菌中。结果纯化出的也是比目的蛋白小的蛋白。。。 我现在已经试过改变各种诱导条件，比如诱导时间、温度、IPTG浓度等等，但都没有显著的影响。 最后放一张我诱导表达的结果图（以重组菌TB1/C2X-目的基因为例），恳求大家给我出出主意，万分感激。 P.S：line1：marker；line2：诱导前；line3：诱导后，图中其实还有line4，就是纯化的结果，只是没有任何条带...  捕获.JPG |
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没有表达。你用BL21已经表达出来了，还换系统干嘛。虽然说DE3系列的菌本底表达量很少，但也不能排除没有的情况。建议你用标签抗体做WB，就能确定是不是目的蛋白，以及蛋白表达量的大概值了。 发自小木虫Android客户端 |
9楼2016-06-16 08:54:11
contactljh
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2楼2016-06-13 15:27:30
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4楼2016-06-13 22:17:55