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xujingyuanxu铜虫 (正式写手)
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请问关于实时荧光定量pcr实验中重复次数的问题
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想向各位朋友们请教一下，在发文章时，基因表达的这一部分用rtqpcr做的话是不是每个样品最少三个生物学重复啊？每个生物学重复要做4-6个重复孔么？ 其次，是不是要测的每个基因都要做一次标曲啊？谢谢 发自小木虫IOS客户端 |
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atlanticwi
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一般做处理，检测基因表达变化的体系，生物学重复并不等于实验重复，我们自己的标准是一次实验重复内包含两个生物学重复，即处理同样的东西两份，也有两个相应的对照。qRT-PCR的技术重复只是检测加样以及实验系统的误差。并不算在真正意义上的与实验相关的重复。所以一般直接取平均值用（除非机械重复很烂，这时候去掉一个离群值，留另两个做平均，利用平均值来相互比对，如果三个值分散太大，那说明实验操作问题，整板实验结果就不可信），同理生物学重复也可以取平均值用，但是会带有自己的SD，你再做三个实验重复，就是利用每一次实验中的三个生物学重复的平均值相互对比，带有自己的SEM，所以问题就来了，误差是可以层层传递的（具体我也没仔细去算过)，真正严格的实验结果去计算显示出来是非常复杂的。同样误差棒也贼大了。 所以就折中用趋势来讨论。实验以一次实验的代表性结果来表示，Mean代表一次实验内的2~3次生物学重复，+/-SD就可以。 第二个问题，基因表达分析，通常用相对定量（2-delta deltaCt法来算），我们不用标曲。 |
4楼2016-05-05 18:14:21
atlanticwi
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.................嗯 对于qRT-PCR来说，每次一个反应必须有三个技术重复，这是绝对不能少的。 一般做处理，需要有生物学重复，我们一般是两个 至于实验重复，一般要求三次，看情况来做 不管你怎么做，Mean+/-SD (SD都应该代表的是生物学重复，而不能用技术重复来糊弄) 如果你实验重复较好，可以酌情做实验重复间的Mean+/-SEM 但如果实验重复之间趋势一致，但基因受调控的程度波动太大，建议图做成一次实验重复内的生物学重复间的Mean+/-SD，然后注明"进行了三次实验，得到相似结果，放入的实验结果为代表性的........"类似话语 个人意见，如有说错，请指正 |
2楼2016-05-05 13:15:32
xujingyuanxu
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谢谢你的解答！我在看文献时，别人在图注中写明了是3个生物学重复，可是没注意到过有写实验重复次数的啊，实验重复次数也会有要求么？按你的解答，我是不是可以这样理解，例如说：一次实验，培养三份植物，测定一个基因的话就要有（3*3）九次技术重复，如果再来三次实验重复的话就是（3*9）27次了？ 还有一个问题想请教：是不是测每个不同基因的表达差异时都要做各自的标曲啊？ 小白求指教 发自小木虫IOS客户端 |
3楼2016-05-05 13:52:20
xujingyuanxu
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5楼2016-05-05 22:32:10
atlanticwi
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根据你的描述，就不会有Ck设置，每个样品中某一基因减掉该样品的内参对照（2^deltaCt法）直接作图即可。 如果必须要2^-deltadeltaCt法来做，找你想要作为对照的那个发育阶段样品来做基准（也就等同处理实验中的Ck），这个样品的基因表达值就会被Normalize到1（2^自己Ct-自己Ct）其他阶段的样品就会以它为参照，成为相对表达量（Y轴的写法也会变） 问题在内参上，不能跟随发育时期有太大变化。 另外可以不设生物学重复，直接实验重复即可，据你所说的情况，在我的理解范围内，如果不涉及处理条件。生物学重复和实验重复是等同的。重复三次保证趋势一致即可。表达量上接近更好 个人理解，如有错误，欢迎指出 |
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xujingyuanxu6楼2016-05-06 00:22:45
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这要看你的实验设计具体如何定义不同发育阶段。比如我们有的时候会把干种子作为对照。或者把出苗的那天作为初始对照。然后同一个处理下采集4个样品。即4个生物学重复。再做2次技术重复。最后得到8个值。可以取舍掉偏差大的。但至少保留6个做图和数据分析。 发自小木虫IOS客户端 |
7楼2016-05-06 02:04:14
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9楼2016-05-06 07:10:18
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一般可以三个生物学重复，每次4个重复孔，技术重复就看你操作了，如果结果很好的话，就不需要技术重复吧。至于标取？应该是指引物的梯度吧？理论上是要的，但实际中很多人往往没有做…… 只要结果是好的就默认引物可以… 发自小木虫IOS客户端 |
10楼2016-05-06 08:43:00