应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 请问关于实时荧光定量pcr实验中重复次数的问题
51/1返回列表
查看: 16386  |  回复: 16
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

xujingyuanxu

铜虫 (正式写手)

[求助] 请问关于实时荧光定量pcr实验中重复次数的问题

想向各位朋友们请教一下，在发文章时，基因表达的这一部分用rtqpcr做的话是不是每个样品最少三个生物学重复啊？每个生物学重复要做4-6个重复孔么？
其次，是不是要测的每个基因都要做一次标曲啊？谢谢

发自小木虫IOS客户端
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
我努力，我坚持，我成功！
1楼 2016-05-05 08:48:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xujingyuanxu

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by atlanticwi at 2016-05-05 13:15:32
.................嗯
对于qRT-PCR来说，每次一个反应必须有三个技术重复，这是绝对不能少的。
一般做处理，需要有生物学重复，我们一般是两个
至于实验重复，一般要求三次，看情况来做

不管你怎么做，Mean+/- ...

谢谢你的解答！我在看文献时，别人在图注中写明了是3个生物学重复，可是没注意到过有写实验重复次数的啊，实验重复次数也会有要求么？按你的解答，我是不是可以这样理解，例如说：一次实验，培养三份植物，测定一个基因的话就要有（3*3）九次技术重复，如果再来三次实验重复的话就是（3*9）27次了？
还有一个问题想请教：是不是测每个不同基因的表达差异时都要做各自的标曲啊？
小白求指教

发自小木虫IOS客户端
赞一下 回复此楼
我努力，我坚持，我成功！
3楼2016-05-05 13:52:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 17 个回答

atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气
.................嗯
对于qRT-PCR来说，每次一个反应必须有三个技术重复，这是绝对不能少的。
一般做处理，需要有生物学重复，我们一般是两个
至于实验重复，一般要求三次，看情况来做

不管你怎么做，Mean+/-SD (SD都应该代表的是生物学重复，而不能用技术重复来糊弄)
如果你实验重复较好，可以酌情做实验重复间的Mean+/-SEM
但如果实验重复之间趋势一致，但基因受调控的程度波动太大，建议图做成一次实验重复内的生物学重复间的Mean+/-SD，然后注明"进行了三次实验，得到相似结果，放入的实验结果为代表性的........"类似话语

个人意见，如有说错，请指正
赞一下(1人) 回复此楼
Let God do with it as He wills
2楼2016-05-05 13:15:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气
引用回帖:
3楼: Originally posted by xujingyuanxu at 2016-05-05 13:52:20
谢谢你的解答！我在看文献时，别人在图注中写明了是3个生物学重复，可是没注意到过有写实验重复次数的啊，实验重复次数也会有要求么？按你的解答，我是不是可以这样理解，例如说：一次实验，培养三份植物，测定一个 ...

一般做处理，检测基因表达变化的体系，生物学重复并不等于实验重复，我们自己的标准是一次实验重复内包含两个生物学重复，即处理同样的东西两份，也有两个相应的对照。qRT-PCR的技术重复只是检测加样以及实验系统的误差。并不算在真正意义上的与实验相关的重复。所以一般直接取平均值用（除非机械重复很烂，这时候去掉一个离群值，留另两个做平均，利用平均值来相互比对，如果三个值分散太大，那说明实验操作问题，整板实验结果就不可信），同理生物学重复也可以取平均值用，但是会带有自己的SD，你再做三个实验重复，就是利用每一次实验中的三个生物学重复的平均值相互对比，带有自己的SEM，所以问题就来了，误差是可以层层传递的（具体我也没仔细去算过)，真正严格的实验结果去计算显示出来是非常复杂的。同样误差棒也贼大了。

所以就折中用趋势来讨论。实验以一次实验的代表性结果来表示，Mean代表一次实验内的2~3次生物学重复，+/-SD就可以。

第二个问题，基因表达分析，通常用相对定量（2-delta deltaCt法来算），我们不用标曲。
赞一下(2人) 回复此楼
Let God do with it as He wills
4楼2016-05-05 18:14:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xujingyuanxu

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by atlanticwi at 2016-05-05 18:14:21
一般做处理，检测基因表达变化的体系，生物学重复并不等于实验重复，我们自己的标准是一次实验重复内包含两个生物学重复，即处理同样的东西两份，也有两个相应的对照。qRT-PCR的技术重复只是检测加样以及实验系统的 ...

大神，你好！非常感谢你耐心的解答！我想做植物不同发育阶段的某个基因表达变化，分成好多阶段，起码5个。没有特殊处理，那么我这里面的CK组该怎么设置呢？

发自小木虫IOS客户端
赞一下 回复此楼
我努力，我坚持，我成功！
5楼2016-05-05 22:32:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 17 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭