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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 荧光定量PCR引物设计原则
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sherry_wang

木虫 (正式写手)

[交流] 荧光定量PCR引物设计原则

荧光定量PCR的引物设计原则是什么呢？原来做半定量PCR，按照普通引物设计原则进行设计，但是今天看下面这篇文献，发现文献中给出同一基因的荧光定量PCR和半定量PCR的引物不同，已知道半定量PCR引物不能用于荧光定量PCR，不知道按说明书上的荧光定量PCR引物设计能不能直接用来做半定量PCR？
http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTotal-YCZZ201603007.htm
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1楼 2016-04-26 16:34:12
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lucky3344

新虫 (初入文坛)
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sherry_wang: 金币+2 2016-05-14 15:58:16
sherry_wang: 金币+1 2016-05-14 15:58:46
这是我们用的荧光定量PCR小册子上的引物设计原则，还有小册子的电子版，希望对你有帮助
荧光定量PCR引物设计原则
图片1.png
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13楼2016-04-29 15:02:45
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)
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sherry_wang: 金币+4 2016-05-14 15:58:08
两种定量方法使用的引物是不一样，不能通用。荧光定量引物除满足常规引物的条件，对PCR产物大小有限制，一般产物大小在90-250bp范围，这个产物如果用来做半定量，条带会和引物二聚体有重合，影响实际定量效果；而半定量一般产物在300-600bp之间。
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2楼2016-04-26 21:13:20
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娟恋幸福

新虫 (小有名气)
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sherry_wang: 金币+1 2016-05-14 15:58:22
DNAMAN里可以直接设计

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3楼2016-04-26 23:44:05
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sherry_wang

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by stone2239 at 2016-04-26 21:13:20
两种定量方法使用的引物是不一样，不能通用。荧光定量引物除满足常规引物的条件，对PCR产物大小有限制，一般产物大小在90-250bp范围，这个产物如果用来做半定量，条带会和引物二聚体有重合，影响实际定量效果；而半 ...

谢谢 产物用来做半定量的意思是荧光定量的产物去跑条带吗？荧光定量引物二聚体是什么意思？
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4楼2016-04-27 10:29:49
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sherry_wang

木虫 (正式写手)
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3楼: Originally posted by 娟恋幸福 at 2016-04-26 23:44:05
DNAMAN里可以直接设计

我用的primer后来也用了NCBI-blast引物设计 按荧光定量试剂盒说明书进行的引物设计 只是不明白两种引物为什么不能通用
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5楼2016-04-27 10:31:51
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)
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4楼: Originally posted by sherry_wang at 2016-04-27 10:29:49
谢谢 产物用来做半定量的意思是荧光定量的产物去跑条带吗？荧光定量引物二聚体是什么意思？...

意思是用荧光定量引物的扩增产物做半定量分析，半定量不就是用PCR产物跑电泳嘛。荧光定量引物二聚体和普通引物二聚体一个意思，就是引物之间局部配对形成二聚体，如果二聚体多，电泳后也会有条带，一般在100-200bp范围，这样就容易与PCR产物条带重叠，互相干扰。
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6楼2016-04-27 14:08:11
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sherry_wang

木虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by stone2239 at 2016-04-27 14:08:11
意思是用荧光定量引物的扩增产物做半定量分析，半定量不就是用PCR产物跑电泳嘛。荧光定量引物二聚体和普通引物二聚体一个意思，就是引物之间局部配对形成二聚体，如果二聚体多，电泳后也会有条带，一般在100-200bp ...

我们以前做半定量的时候是直接用普通PCR仪扩增的产物去跑电泳，我看有杂志要求荧光定量数据和电泳图都要有，是用荧光定量的产物去跑的电泳吗？
另，引物二聚体那个解释清楚了，但是设计引物的时候，也会有软件评价是否会出现引物二聚体配对等问题，谢谢。
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7楼2016-04-27 22:31:04
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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7楼: Originally posted by sherry_wang at 2016-04-27 22:31:04
我们以前做半定量的时候是直接用普通PCR仪扩增的产物去跑电泳，我看有杂志要求荧光定量数据和电泳图都要有，是用荧光定量的产物去跑的电泳吗？
另，引物二聚体那个解释清楚了，但是设计引物的时候，也会有软件评价 ...

你可以用荧光定量的产物跑电泳，关于二聚体，只是说有可能，软件评价不是万能的。
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8楼2016-04-27 23:08:14
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娟恋幸福

新虫 (小有名气)
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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5楼: Originally posted by sherry_wang at 2016-04-27 10:31:51
我用的primer后来也用了NCBI-blast引物设计 按荧光定量试剂盒说明书进行的引物设计 只是不明白两种引物为什么不能通用...

我直接用的全式金的MIX

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9楼2016-04-28 07:30:17
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tibm

新虫 (正式写手)
好帖

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10楼2016-04-28 08:26:08
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