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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 启动子序列扩增不出来
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花落已季末

银虫 (小有名气)

[求助] 启动子序列扩增不出来

最近想要把一个质粒上的启动子序列和抗性基因扩增下来，一共3000多bp，用的宝生物的高保真酶，引物通过比对特异性挺高，退火温度也根据Tm值－5做了梯度，但扩增出来的条带一直是1000多，请各位高手支招该怎么办？

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流年似水，看不透的是红尘中镜花水月；往事如烟，挥不去的是岁月荏苒一过往；待得繁华落尽，只余回忆。
1楼 2016-04-16 21:47:42
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爱笑的芳宝8

新虫 (初入文坛)
这位仁兄，请问已知一段基因和它的上游序列如何查找它的启动子呢？

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4楼2016-12-26 15:59:12
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sayen

银虫 (小有名气)
质粒是很纯的，从质粒上p应该很好弄，首先确定你的引物是否特异性只针对那3000bp扩增

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2楼2016-04-17 00:20:52
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sayen

银虫 (小有名气)
然后建议用takara的prime star高保真酶做克隆

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3楼2016-04-17 00:22:24
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531536142

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
1楼: Originally posted by 花落已季末 at 2016-04-16 21:47:42
最近想要把一个质粒上的启动子序列和抗性基因扩增下来，一共3000多bp，用的宝生物的高保真酶，引物通过比对特异性挺高，退火温度也根据Tm值－5做了梯度，但扩增出来的条带一直是1000多，请各位高手支招该怎么办？
b ...

我一般克隆时候就是，Tm值是多少就按多少设退火温度，我最近也克隆3k的启动子，每次克隆都成功

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5楼2016-12-27 01:23:06
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