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jiangpozi

新虫 (小有名气)

[求助] 多点突变求助 已有3人参与

各位大侠好,我已经用质粒扩增,DPNI消化,然后转化获得了单点突变质粒,现在想要在突变3个位点,还用这种方法做,那怎么做呢?
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猛兽

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
引用回帖:
4楼: Originally posted by jiangpozi at 2016-04-05 22:55:35
请问可以这么做吗?引物之间退火温度不一样,还有它们会连起来吗?...

可以以构建好的质粒为模板再一个一个构建,当然这样做很麻烦,需要三次克隆构建过程。如果这三个突变之间的距离较远可以设计三对突变引物,先分别扩增四个片段,然后再将这四个片段放到一起使用两端引物进行搭桥扩增即可。
5楼2016-04-06 08:10:08
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江苏虞游

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
13楼: Originally posted by jiangpozi at 2016-04-15 15:21:28
主要是我现在设计的是DPNI消化的方法,而且片段都在质粒上了...

那方法一样的,质粒不大的话就可以直接设计引物做overlap,再用酶消化即可。如果质粒太大,建议把你的片段从质粒上切下来做完突变再连进去,我个人推荐后者

发自小木虫IOS客户端
14楼2016-04-15 22:35:48
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普通回帖

jiangpozi

新虫 (小有名气)

有没有人指导下呢
2楼2016-04-05 15:04:41
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biosci

捐助贵宾 (知名作家)


同时突变3个,那就三对引物放进去同时做呗

发自小木虫Android客户端
3楼2016-04-05 20:50:29
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jiangpozi

新虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by biosci at 2016-04-05 20:50:29
同时突变3个,那就三对引物放进去同时做呗

请问可以这么做吗?引物之间退火温度不一样,还有它们会连起来吗?
4楼2016-04-05 22:55:35
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jiangpozi

新虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by 猛兽 at 2016-04-06 08:10:08
可以以构建好的质粒为模板再一个一个构建,当然这样做很麻烦,需要三次克隆构建过程。如果这三个突变之间的距离较远可以设计三对突变引物,先分别扩增四个片段,然后再将这四个片段放到一起使用两端引物进行搭桥扩 ...

谢谢你的热心帮助。现在我是构键好了一个突变体,而且设计的引物都是根据质粒扩增来设计的,看到多点突变试剂盒中也是把几对引物一起放进去,不知道扩增的片段是怎么连接起来的?
6楼2016-04-06 09:56:37
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yeruge

新虫 (小有名气)

用全式金无缝克隆试剂盒,设计在突变位点设计三对引物即可,但是引物设计要根据说明书来设计,属于特殊引物。还有不懂,再问

发自小木虫Android客户端
7楼2016-04-07 07:45:34
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jiangpozi

新虫 (小有名气)

引用回帖:
7楼: Originally posted by yeruge at 2016-04-07 07:45:34
用全式金无缝克隆试剂盒,设计在突变位点设计三对引物即可,但是引物设计要根据说明书来设计,属于特殊引物。还有不懂,再问

谢谢!我已经设计了三段引物了,都是按照突变体引物原则设计的,没有试剂盒,和做单点突变一样吗??
8楼2016-04-07 09:52:48
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yeruge

新虫 (小有名气)

9楼2016-04-07 12:13:46
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jiangpozi

新虫 (小有名气)

引用回帖:
9楼: Originally posted by yeruge at 2016-04-07 12:13:46
不一样的

那我 能用现在的引物取做吗?
10楼2016-04-07 13:01:45
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