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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 多点突变求助
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jiangpozi

新虫 (小有名气)

[求助] 多点突变求助已有3人参与

各位大侠好，我已经用质粒扩增，DPNI消化，然后转化获得了单点突变质粒，现在想要在突变3个位点，还用这种方法做，那怎么做呢?
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1楼2016-04-05 14:56:12
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猛兽

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
4楼: Originally posted by jiangpozi at 2016-04-05 22:55:35
请问可以这么做吗？引物之间退火温度不一样，还有它们会连起来吗？...

可以以构建好的质粒为模板再一个一个构建，当然这样做很麻烦，需要三次克隆构建过程。如果这三个突变之间的距离较远可以设计三对突变引物，先分别扩增四个片段，然后再将这四个片段放到一起使用两端引物进行搭桥扩增即可。
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5楼2016-04-06 08:10:08
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江苏虞游

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
13楼: Originally posted by jiangpozi at 2016-04-15 15:21:28
主要是我现在设计的是DPNI消化的方法，而且片段都在质粒上了...

那方法一样的，质粒不大的话就可以直接设计引物做overlap，再用酶消化即可。如果质粒太大，建议把你的片段从质粒上切下来做完突变再连进去，我个人推荐后者

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14楼2016-04-15 22:35:48
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普通回帖

jiangpozi

新虫 (小有名气)
有没有人指导下呢
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2楼2016-04-05 15:04:41
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biosci

捐助贵宾 (职业作家)
同时突变3个，那就三对引物放进去同时做呗

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3楼2016-04-05 20:50:29
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jiangpozi

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by biosci at 2016-04-05 20:50:29
同时突变3个，那就三对引物放进去同时做呗

请问可以这么做吗？引物之间退火温度不一样，还有它们会连起来吗？
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4楼2016-04-05 22:55:35
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jiangpozi

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 猛兽 at 2016-04-06 08:10:08
可以以构建好的质粒为模板再一个一个构建，当然这样做很麻烦，需要三次克隆构建过程。如果这三个突变之间的距离较远可以设计三对突变引物，先分别扩增四个片段，然后再将这四个片段放到一起使用两端引物进行搭桥扩 ...

谢谢你的热心帮助。现在我是构键好了一个突变体，而且设计的引物都是根据质粒扩增来设计的，看到多点突变试剂盒中也是把几对引物一起放进去，不知道扩增的片段是怎么连接起来的？
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6楼2016-04-06 09:56:37
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yeruge

新虫 (小有名气)
用全式金无缝克隆试剂盒，设计在突变位点设计三对引物即可，但是引物设计要根据说明书来设计，属于特殊引物。还有不懂，再问

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7楼2016-04-07 07:45:34
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jiangpozi

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by yeruge at 2016-04-07 07:45:34
用全式金无缝克隆试剂盒，设计在突变位点设计三对引物即可，但是引物设计要根据说明书来设计，属于特殊引物。还有不懂，再问

谢谢！我已经设计了三段引物了，都是按照突变体引物原则设计的，没有试剂盒，和做单点突变一样吗？？
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8楼2016-04-07 09:52:48
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yeruge

新虫 (小有名气)
不一样的

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9楼2016-04-07 12:13:46
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jiangpozi

新虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by yeruge at 2016-04-07 12:13:46
不一样的

那我 能用现在的引物取做吗？
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10楼2016-04-07 13:01:45
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