【答案】应助回帖

11楼2016-04-07 21:33:57

江苏虞游

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可以用overlap PCR，想突变几个就突变几个

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12楼2016-04-09 12:39:28

jiangpozi

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12楼: Originally posted by 江苏虞游 at 2016-04-09 12:39:28
可以用overlap PCR，想突变几个就突变几个

主要是我现在设计的是DPNI消化的方法，而且片段都在质粒上了

13楼2016-04-15 15:21:28

江苏虞游

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13楼: Originally posted by jiangpozi at 2016-04-15 15:21:28
主要是我现在设计的是DPNI消化的方法，而且片段都在质粒上了...

那方法一样的，质粒不大的话就可以直接设计引物做overlap，再用酶消化即可。如果质粒太大，建议把你的片段从质粒上切下来做完突变再连进去，我个人推荐后者

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14楼2016-04-15 22:35:48

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14楼: Originally posted by 江苏虞游 at 2016-04-15 22:35:48
那方法一样的，质粒不大的话就可以直接设计引物做overlap，再用酶消化即可。如果质粒太大，建议把你的片段从质粒上切下来做完突变再连进去，我个人推荐后者
...

我的质粒5400bp ,片段1400bp，

15楼2016-04-18 10:45:05

江苏虞游

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15楼: Originally posted by jiangpozi at 2016-04-18 10:45:05
我的质粒5400bp ,片段1400bp，...

那我建议你把片段切下来，纯化出来当作模板，突变之后再连进去就可以了

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16楼2016-04-18 13:35:01

jiangpozi

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16楼: Originally posted by 江苏虞游 at 2016-04-18 13:35:01
那我建议你把片段切下来，纯化出来当作模板，突变之后再连进去就可以了
...

我现在是以一个突变体质粒为模板，再P另一个突变体，但是测序发现本来以突变体为模板的那个突变点又变回原来的了，得到的只有一个点的突变，这好郁闷啊！

17楼2016-04-20 14:38:13

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17楼: Originally posted by jiangpozi at 2016-04-20 14:38:13
我现在是以一个突变体质粒为模板，再P另一个突变体，但是测序发现本来以突变体为模板的那个突变点又变回原来的了，得到的只有一个点的突变，这好郁闷啊！...

第一个突变质粒测序了吗？

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18楼2016-04-21 12:51:47

jiangpozi

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18楼: Originally posted by 江苏虞游 at 2016-04-21 12:51:47
第一个突变质粒测序了吗？
...

测序了，是突变的，我想着不应该会突变回去啊，所以我再做一次，希望是我那错了模板PCR

19楼2016-04-21 13:53:46

jiangpozi

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12楼: Originally posted by 江苏虞游 at 2016-04-09 12:39:28
可以用overlap PCR，想突变几个就突变几个

请问下，我P质粒的时候会不会质粒上的碱基也会有突变呀，我测序了目的片段是正确的，这就可以用这个质粒了吗？我担心质粒会不会有变化。

20楼2016-04-28 16:56:53