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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 分子生理 » 双荧光素酶报告基因问题 LUC REN
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玉兔Jane

新虫 (小有名气)

[求助] 双荧光素酶报告基因问题 LUC REN 已有1人参与

1个转录因子，1个启动子，想要研究转录因子对启动子的调控。
实验设计：
1、构建转录因子过表达载体，TF
2、构建启动子+LUC载体，p
3、单独的一个载体，REN海肾荧光素酶载体作为内参，ren
4、35sTF+p+ren     35s空载+p+ren    3个载体共转化拟南芥原生质体，使用Promega试剂盒，单管测LUC，REN荧光，不是用的酶标仪。
结果：不同样品之间，海肾荧光素酶REN的值差别挺大，最小的500，最大的10000。空白对照（原生质体没有加质粒，后面步骤一样的），100左右，所以转化是成功了吧。
问题：理论上来说，不同样品之间的REN值应该差不多的啊，感觉操作也没啥问题，差异这么大，可能的原因有哪些？
谢谢啦～
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1楼 2016-03-26 15:06:31
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小崔姐姐03

新虫 (初入文坛)
感觉500的是不对的，因为不加质粒的空白对照的值，通常比其它的值小一百倍，才是正确的

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2楼2016-03-26 15:15:59
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玉兔Jane

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 小崔姐姐03 at 2016-03-26 15:15:59
感觉500的是不对的，因为不加质粒的空白对照的值，通常比其它的值小一百倍，才是正确的

谢谢！你的实验结果ren值不同样品差异大吗？一百倍的话，按照我的空白100计算的话，所有的结果都是不对的了
因为海肾荧光素酶是作为对照，质粒加的少一些，所以这个值没有很高。
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3楼2016-03-26 15:38:45
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心拼命的痛

银虫 (初入文坛)
什么仪器测的
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4楼2016-05-07 15:55:05
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拍个黄瓜

新虫 (初入文坛)
质粒间产生cross talk导致，可换成pGl4 Renilla-TK的载体，并对转录因子质粒，Firefly和Renilla质粒做优化

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5楼2016-06-14 22:16:24
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科研屌丝007

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

您好，我刚开始接触双荧光实验，遇到一个问题的，想向您请教。我的空白组中，海参荧光素酶的数值高达8649，实验组和阴性对照组分别是22503.2、12504.6。请问为什么空白组中的数值会这么高？要是按照100倍的理论的话，那我的就更不合格了。
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6楼2016-08-15 12:58:03
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硫苏妖儿

木虫 (小有名气)

小菜鸟
引用回帖:
2楼: Originally posted by 小崔姐姐03 at 2016-03-26 15:15:59
感觉500的是不对的，因为不加质粒的空白对照的值，通常比其它的值小一百倍，才是正确的

你好 请问你做这个实验的时候，用的是什么仪器呢  多功能酶标仪和全波长酶标仪可以检测LUC的表达量嘛 因该用什么波段呢？
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我不知道该写些什么
7楼2017-02-21 12:16:01
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央宗兰泽

新虫 (初入文坛)
老师你好，我也在做这方面的实验，我想问一下，这个荧光素酶报告基因的是用什么仪器检测的，可以用酶标仪吗？还是荧光显微镜，如果是荧光显微镜的话，是普通的就可以还是的用倒置的？

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8楼2017-02-27 22:07:05
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