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玉兔Jane

新虫 (小有名气)

[求助] 双荧光素酶报告基因问题 LUC REN 已有1人参与

1个转录因子,1个启动子,想要研究转录因子对启动子的调控。
实验设计:
1、构建转录因子过表达载体,TF
2、构建启动子+LUC载体,p
3、单独的一个载体,REN海肾荧光素酶载体作为内参,ren
4、35sTF+p+ren     35s空载+p+ren    3个载体共转化拟南芥原生质体,使用Promega试剂盒,单管测LUC,REN荧光,不是用的酶标仪。
结果:不同样品之间,海肾荧光素酶REN的值差别挺大,最小的500,最大的10000。空白对照(原生质体没有加质粒,后面步骤一样的),100左右,所以转化是成功了吧。
问题:理论上来说,不同样品之间的REN值应该差不多的啊,感觉操作也没啥问题,差异这么大,可能的原因有哪些?
谢谢啦~
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科研屌丝007

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

您好,我刚开始接触双荧光实验,遇到一个问题的,想向您请教。我的空白组中,海参荧光素酶的数值高达8649,实验组和阴性对照组分别是22503.2、12504.6。请问为什么空白组中的数值会这么高?要是按照100倍的理论的话,那我的就更不合格了。
6楼2016-08-15 12:58:03
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小崔姐姐03

新虫 (初入文坛)

感觉500的是不对的,因为不加质粒的空白对照的值,通常比其它的值小一百倍,才是正确的

发自小木虫IOS客户端
2楼2016-03-26 15:15:59
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玉兔Jane

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 小崔姐姐03 at 2016-03-26 15:15:59
感觉500的是不对的,因为不加质粒的空白对照的值,通常比其它的值小一百倍,才是正确的

谢谢!你的实验结果ren值不同样品差异大吗?一百倍的话,按照我的空白100计算的话,所有的结果都是不对的了
因为海肾荧光素酶是作为对照,质粒加的少一些,所以这个值没有很高。
3楼2016-03-26 15:38:45
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拍个黄瓜

新虫 (初入文坛)

质粒间产生cross talk导致,可换成pGl4 Renilla-TK的载体,并对转录因子质粒,Firefly和Renilla质粒做优化

发自小木虫Android客户端
5楼2016-06-14 22:16:24
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