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关于质粒构建的疑难问题，求指点！！！！已有2人参与
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请教质粒构建前辈~目前我想构建某一基因的表达载体，已从cDNA上成功调取该基因，目标基因的大小是2000bp，想要构建到VR1012（4900bp）这个真核表达载体上，使用PCR方法获得酶切位点然后连入双酶切的载体，PCR后核酸胶验证目标条带大小正确，胶回收，同时酶切载体胶回收，将目的基因的正义链与反义链退火（94℃ 10min, 25℃ 30min），连接载体，TOP10感受态转化后，挑单克隆，鉴定（双酶切以及菌液PCR）发现目标基因变短了！  测序发现基因变成了△975-1431nt缺失，少了456bp，反复了3次以上都是这样，请问各位大牛有人知道这种情况是如何造成的？有什么方法能避免，我用相同的方法构建了另外4个基因都没有这样的问题…… |
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