应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 关于质粒构建的疑难问题，求指点！！！！
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
141/2返回列表12下一页
查看: 2055  |  回复: 13
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

BESTWWZ

新虫 (初入文坛)

[求助] 关于质粒构建的疑难问题，求指点！！！！ 已有2人参与

请教质粒构建前辈~目前我想构建某一基因的表达载体，已从cDNA上成功调取该基因，目标基因的大小是2000bp，想要构建到VR1012（4900bp）这个真核表达载体上，使用PCR方法获得酶切位点然后连入双酶切的载体，PCR后核酸胶验证目标条带大小正确，胶回收，同时酶切载体胶回收，将目的基因的正义链与反义链退火（94℃ 10min, 25℃ 30min），连接载体，TOP10感受态转化后，挑单克隆，鉴定（双酶切以及菌液PCR）发现目标基因变短了！测序发现基因变成了△975-1431nt缺失，少了456bp，反复了3次以上都是这样，请问各位大牛有人知道这种情况是如何造成的？有什么方法能避免，我用相同的方法构建了另外4个基因都没有这样的问题……
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2016-03-20 15:05:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

兰兰园丁

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-03-21 08:43:48
最大的可能就是你酶切位点选的不对，基因内部可能还有一个位点，因此导致变短

发自小木虫Android客户端
赞一下(1人) 回复此楼
3楼2016-03-21 00:10:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

siriusxuan

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2016-03-21 08:43:23
将目的基因的正义链与反义链退火（94℃ 10min, 25℃ 30min）
看不懂，这是在干啥，PCR后的产物胶回收再酶切，是要有保护碱基的。
但如果你做出来过，可能是你没描述好，
建议或者可能的原因，这2000bp的基因内部，有你选择的双酶切位点中的一个。
用软件查一下试试看。
赞一下 回复此楼
此座可言轻社稷，江山万里起风尘。
2楼2016-03-21 00:02:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

star013

新虫 (知名作家)
我们公司可以帮你解决这种问题

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
4楼2016-03-21 06:03:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

BESTWWZ

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by siriusxuan at 2016-03-21 00:02:37
将目的基因的正义链与反义链退火（94℃ 10min, 25℃ 30min）
看不懂，这是在干啥，PCR后的产物胶回收再酶切，是要有保护碱基的。
但如果你做出来过，可能是你没描述好，
建议或者可能的原因，这2000bp的基因内部 ...

你好，感谢您的回答，我好像是没有解释清楚，我是用PCR法获得的粘性末端，也就是PCR的时候分别扩增产物的正义链和反义链，两个链的开头和末尾的粘性末端是用特异性引物PCR扩增出来的，所以需要退火，然后与双酶切的产物进行连接，所以除了在制备具有粘性末端的载体以外，带有粘性末端的目的基因并没有经过真正的酶切，在构建设计的时候确实查过目的基因中没有这两个酶切位点，您觉得还有什么可能吗？
赞一下 回复此楼
5楼2016-03-21 16:19:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

BESTWWZ

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by siriusxuan at 2016-03-21 00:02:37
将目的基因的正义链与反义链退火（94℃ 10min, 25℃ 30min）
看不懂，这是在干啥，PCR后的产物胶回收再酶切，是要有保护碱基的。
但如果你做出来过，可能是你没描述好，
建议或者可能的原因，这2000bp的基因内部 ...

你好，谢谢您的回答，就退火问题，是这样的，对于目的基因，我并没有采用酶切的方法获得粘性末端，而是采用PCR方法，分别PCR扩增了产物的正义链和反义链，并在两端的引物中设计了模拟酶切好的粘性末端，也就是粘性末端是P出来的，具有粘性末端的正义链和反义链在两头是有区别的，所以最后要退火形成新的双链；载体是正常酶切胶回收的，所以目的片段并没有经过真正的酶切，您觉得除了可能存在酶切位点以外，还有什么可能性吗？
赞一下 回复此楼
6楼2016-03-21 16:26:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

BESTWWZ

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 兰兰园丁 at 2016-03-21 00:10:09
最大的可能就是你酶切位点选的不对，基因内部可能还有一个位点，因此导致变短

您好，我已检查了酶切位点，目的基因里面确实没有的，您觉得还有什么可能吗？
赞一下 回复此楼
7楼2016-03-21 16:28:11
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

siriusxuan

木虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by BESTWWZ at 2016-03-21 16:19:41
你好，感谢您的回答，我好像是没有解释清楚，我是用PCR法获得的粘性末端，也就是PCR的时候分别扩增产物的正义链和反义链，两个链的开头和末尾的粘性末端是用特异性引物PCR扩增出来的，所以需要退火，然后与双酶切的 ...

退火这一步骤，虽然原理上可行，但我并没有这样子做过。
建议PCR后产物TA克隆，或者带有保护碱基直接酶切。
赞一下 回复此楼
此座可言轻社稷，江山万里起风尘。
8楼2016-03-21 17:38:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yvonne9044

新虫 (正式写手)
同意8楼的说法

发自小木虫Android客户端
回复此楼
9楼2016-03-24 14:04:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

海忆梦奇

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by siriusxuan at 2016-03-21 17:38:27
退火这一步骤，虽然原理上可行，但我并没有这样子做过。
建议PCR后产物TA克隆，或者带有保护碱基直接酶切。...

你好！想问一下，引物加酶切位点和保护碱基是如何选择的？苦恼好久了，求助大神！
赞一下 回复此楼
10楼2016-04-27 10:58:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 BESTWWZ 的主题更新
141/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 0703 化学 求调剂，一志愿山东大学 342 分 +5 Shern—- 2026-03-28 5/250 2026-03-29 23:32 by 飞行日记西
[考研] 277跪求调剂 +6 1915668 2026-03-27 10/500 2026-03-29 16:03 by 王亮_大连医科大
[考研] 352分-085602-一志愿985 +5 海纳百川Ly 2026-03-29 5/250 2026-03-29 09:57 by Sjndkwm
[考研] 298求调剂 +4 种圣赐 2026-03-28 4/200 2026-03-29 08:42 by q1092522407
[考研] 330分求调剂 +5 qzenlc 2026-03-29 5/250 2026-03-29 07:37 by 无际的草原
[考研] 一志愿北化085600材料专硕275|有文章专利｜求调剂 +7 Micky11223 2026-03-25 7/350 2026-03-28 18:34 by 无际的草原
[考研] 347求调剂 +3 山顶见α 2026-03-25 3/150 2026-03-28 14:13 by 唐沐儿
[考研] 266分，求材料冶金能源化工等调剂 +7 哇呼哼呼哼 2026-03-27 9/450 2026-03-28 12:22 by zllcz
[考研] 材料求调剂一志愿哈工大324 +7 闫旭东 2026-03-28 9/450 2026-03-28 08:51 by Xu de nuo
[考研] 265求调剂11408 +3 刘小鹿lu 2026-03-27 3/150 2026-03-27 20:53 by nihaoar
[考研] 266求调剂 +11 阳阳哇塞 2026-03-27 12/600 2026-03-27 17:56 by yu221
[考研] 085600材料与化工调剂 +10 A-哆啦Z梦 2026-03-23 16/800 2026-03-27 15:13 by caszguilin
[考研] 279 分 求调剂 +4 睡个好觉_16 2026-03-24 4/200 2026-03-27 15:05 by 醉在风里
[考研] 求调剂323材料与化工 +7 1124361 2026-03-24 7/350 2026-03-27 10:22 by wangjy2002
[考研] 求调剂 +6 林之夕 2026-03-24 6/300 2026-03-27 08:38 by hypershenger
[考研] 325求调剂 +5 李嘉图·S·路 2026-03-23 5/250 2026-03-27 00:42 by wxiongid
[考研] 中国科学院深圳先进技术研究院-光纤传感课题组招生-中国科学院大学、深圳理工大学联培 +5 YangTyu1 2026-03-26 5/250 2026-03-26 18:27 by 猫咪猫咪呀
[考研] 303求调剂 +6 蓝山月 2026-03-25 6/300 2026-03-25 22:47 by 418490947
[考研] 考研一志愿苏州大学初始315（英一）求调剂 +3 sbdksD 2026-03-24 4/200 2026-03-25 18:16 by xcjcqu
[考研] 接收2026硕士调剂(学硕+专硕) +4 allen-yin 2026-03-23 6/300 2026-03-23 15:04 by 汪！？！
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭