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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 关于质粒构建的疑难问题，求指点！！！！
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BESTWWZ

新虫 (初入文坛)

[求助] 关于质粒构建的疑难问题，求指点！！！！已有2人参与

请教质粒构建前辈~目前我想构建某一基因的表达载体，已从cDNA上成功调取该基因，目标基因的大小是2000bp，想要构建到VR1012（4900bp）这个真核表达载体上，使用PCR方法获得酶切位点然后连入双酶切的载体，PCR后核酸胶验证目标条带大小正确，胶回收，同时酶切载体胶回收，将目的基因的正义链与反义链退火（94℃ 10min, 25℃ 30min），连接载体，TOP10感受态转化后，挑单克隆，鉴定（双酶切以及菌液PCR）发现目标基因变短了！测序发现基因变成了△975-1431nt缺失，少了456bp，反复了3次以上都是这样，请问各位大牛有人知道这种情况是如何造成的？有什么方法能避免，我用相同的方法构建了另外4个基因都没有这样的问题……
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1楼2016-03-20 15:05:51
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兰兰园丁

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-03-21 08:43:48
最大的可能就是你酶切位点选的不对，基因内部可能还有一个位点，因此导致变短

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3楼2016-03-21 00:10:09
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siriusxuan

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2016-03-21 08:43:23
将目的基因的正义链与反义链退火（94℃ 10min, 25℃ 30min）
看不懂，这是在干啥，PCR后的产物胶回收再酶切，是要有保护碱基的。
但如果你做出来过，可能是你没描述好，
建议或者可能的原因，这2000bp的基因内部，有你选择的双酶切位点中的一个。
用软件查一下试试看。
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此座可言轻社稷，江山万里起风尘。
2楼2016-03-21 00:02:37
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star013

新虫 (知名作家)
我们公司可以帮你解决这种问题

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4楼2016-03-21 06:03:40
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BESTWWZ

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by siriusxuan at 2016-03-21 00:02:37
将目的基因的正义链与反义链退火（94℃ 10min, 25℃ 30min）
看不懂，这是在干啥，PCR后的产物胶回收再酶切，是要有保护碱基的。
但如果你做出来过，可能是你没描述好，
建议或者可能的原因，这2000bp的基因内部 ...

你好，感谢您的回答，我好像是没有解释清楚，我是用PCR法获得的粘性末端，也就是PCR的时候分别扩增产物的正义链和反义链，两个链的开头和末尾的粘性末端是用特异性引物PCR扩增出来的，所以需要退火，然后与双酶切的产物进行连接，所以除了在制备具有粘性末端的载体以外，带有粘性末端的目的基因并没有经过真正的酶切，在构建设计的时候确实查过目的基因中没有这两个酶切位点，您觉得还有什么可能吗？
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5楼2016-03-21 16:19:41
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BESTWWZ

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by siriusxuan at 2016-03-21 00:02:37
将目的基因的正义链与反义链退火（94℃ 10min, 25℃ 30min）
看不懂，这是在干啥，PCR后的产物胶回收再酶切，是要有保护碱基的。
但如果你做出来过，可能是你没描述好，
建议或者可能的原因，这2000bp的基因内部 ...

你好，谢谢您的回答，就退火问题，是这样的，对于目的基因，我并没有采用酶切的方法获得粘性末端，而是采用PCR方法，分别PCR扩增了产物的正义链和反义链，并在两端的引物中设计了模拟酶切好的粘性末端，也就是粘性末端是P出来的，具有粘性末端的正义链和反义链在两头是有区别的，所以最后要退火形成新的双链；载体是正常酶切胶回收的，所以目的片段并没有经过真正的酶切，您觉得除了可能存在酶切位点以外，还有什么可能性吗？
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6楼2016-03-21 16:26:13
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BESTWWZ

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 兰兰园丁 at 2016-03-21 00:10:09
最大的可能就是你酶切位点选的不对，基因内部可能还有一个位点，因此导致变短

您好，我已检查了酶切位点，目的基因里面确实没有的，您觉得还有什么可能吗？
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7楼2016-03-21 16:28:11
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siriusxuan

木虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by BESTWWZ at 2016-03-21 16:19:41
你好，感谢您的回答，我好像是没有解释清楚，我是用PCR法获得的粘性末端，也就是PCR的时候分别扩增产物的正义链和反义链，两个链的开头和末尾的粘性末端是用特异性引物PCR扩增出来的，所以需要退火，然后与双酶切的 ...

退火这一步骤，虽然原理上可行，但我并没有这样子做过。
建议PCR后产物TA克隆，或者带有保护碱基直接酶切。
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此座可言轻社稷，江山万里起风尘。
8楼2016-03-21 17:38:27
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yvonne9044

新虫 (正式写手)
同意8楼的说法

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9楼2016-03-24 14:04:00
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海忆梦奇

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by siriusxuan at 2016-03-21 17:38:27
退火这一步骤，虽然原理上可行，但我并没有这样子做过。
建议PCR后产物TA克隆，或者带有保护碱基直接酶切。...

你好！想问一下，引物加酶切位点和保护碱基是如何选择的？苦恼好久了，求助大神！
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10楼2016-04-27 10:58:36
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