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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 荧光定量PCR问题
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丫头珠

金虫 (小有名气)

[求助] 荧光定量PCR问题 已有1人参与

我做荧光定量PCR的时候，选用18S作为内参，结果显示CT值小于10，而其他基因CT值都是20-30，师兄说模板浓度过高，让我做一个梯度找到合适的浓度，我不明白的地方是模板稀释之后，虽然内参的CT值达到了正常范围，但是其他基因的CT值会不会减小好多，我很疑惑！求助各位大神帮忙。
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1楼 2016-03-15 11:04:20
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wyy9918

银虫 (初入文坛)
稀释后目的基因的Ct肯定会减小的。模板做个梯度稀释，做个标曲算下引物的扩增效率，这样也可以选择下稀释的倍数，让内参和目的基因的Ct值都在合适的范围内。

发自小木虫Android客户端
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3楼2016-03-15 13:17:09
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卡维斯

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
做定量时候，内参基因的Ct值要在一个合理范围内，这样做相对定量时才会有可比性和可信度。通常这个范围与所用内参基因的种类和物种有关，具体的可以参考有关文献的使用。18S小于10缺失模板浓度太高，我们做玉米用18S是通常18左右，其他基因Ct值虽然会增大，但是不超过35一般没有什么问题，毕竟是目的基因/内参基因。
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2楼2016-03-15 11:15:30
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丫头珠

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 卡维斯 at 2016-03-15 11:15:30
做定量时候，内参基因的Ct值要在一个合理范围内，这样做相对定量时才会有可比性和可信度。通常这个范围与所用内参基因的种类和物种有关，具体的可以参考有关文献的使用。18S小于10缺失模板浓度太高，我们做玉米用18 ...

好的，多谢，我试下
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4楼2016-03-15 18:18:26
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丫头珠

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 卡维斯 at 2016-03-15 11:15:30
做定量时候，内参基因的Ct值要在一个合理范围内，这样做相对定量时才会有可比性和可信度。通常这个范围与所用内参基因的种类和物种有关，具体的可以参考有关文献的使用。18S小于10缺失模板浓度太高，我们做玉米用18 ...

我做了梯度稀释，但是稀释后目的基因的ct值大于30，内参的ct值也变化不是很大，师兄看了说还是不稀释的好，让我换个内参，可是我找不到更合适的内参
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5楼2016-03-17 10:17:01
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