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零星风前絮

银虫 (小有名气)

[求助] 关于t载体的连接求助 已有1人参与

在实验室实习,看到takara公司的pmd19T载体说明书上说16℃连接三十分钟,而实验室的师兄师姐都是过夜连接?差别大么?如果时间比较赶该怎么做?谢谢各位!

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ddt123456789

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
1楼: Originally posted by 零星风前絮 at 2016-03-06 16:21:17
在实验室实习,看到takara公司的pmd19T载体说明书上说16℃连接三十分钟,而实验室的师兄师姐都是过夜连接?差别大么?如果时间比较赶该怎么做?谢谢各位!

公司为了能把产品卖出去,肯定不会给一份错误的protocol,所以可以大胆地按照protocol来,根据本科实习的经验来看,过夜对效率的提升并不明显。因为Taq保真度的问题,现在都改用高保真酶,所以基本上T载体就用不着了

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7楼2016-03-07 00:07:43
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ddt123456789

新虫 (初入文坛)

过夜连接差别不大,都是利用taq在扩增时末端多出来一个A和载体上的T互补配对,连接的体系会达到一个动态平衡,一般公司推荐的连接时间会有些富余,你可以试试缩短时间,看最终连接效果摸出一个能接受的最短时间。

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2楼2016-03-06 17:05:56
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零星风前絮

银虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by ddt123456789 at 2016-03-06 17:05:56
过夜连接差别不大,都是利用taq在扩增时末端多出来一个A和载体上的T互补配对,连接的体系会达到一个动态平衡,一般公司推荐的连接时间会有些富余,你可以试试缩短时间,看最终连接效果摸出一个能接受的最短时间。
...

谢谢回复!但是公司说明书的时间比实验室师兄师姐用的短的多,会影响连接效率么?另,请问你平时连接是什么条件,多长时间?谢谢

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3楼2016-03-06 17:56:08
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jackyoung

新虫 (正式写手)

谁用谁知道,用这个系列的载体那个效率还是有点儿低,后来就果断换了拓扑异构酶连接载体了。

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CestLaVie
4楼2016-03-06 18:22:16
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