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零星风前絮

银虫 (小有名气)

[求助] 关于t载体的连接求助 已有1人参与

在实验室实习，看到takara公司的pmd19T载体说明书上说16℃连接三十分钟，而实验室的师兄师姐都是过夜连接？差别大么？如果时间比较赶该怎么做？谢谢各位！

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1楼 2016-03-06 16:21:17
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ddt123456789

新虫 (初入文坛)
过夜连接差别不大，都是利用taq在扩增时末端多出来一个A和载体上的T互补配对，连接的体系会达到一个动态平衡，一般公司推荐的连接时间会有些富余，你可以试试缩短时间，看最终连接效果摸出一个能接受的最短时间。

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2楼2016-03-06 17:05:56
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零星风前絮

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by ddt123456789 at 2016-03-06 17:05:56
过夜连接差别不大，都是利用taq在扩增时末端多出来一个A和载体上的T互补配对，连接的体系会达到一个动态平衡，一般公司推荐的连接时间会有些富余，你可以试试缩短时间，看最终连接效果摸出一个能接受的最短时间。
...

谢谢回复！但是公司说明书的时间比实验室师兄师姐用的短的多，会影响连接效率么？另，请问你平时连接是什么条件，多长时间？谢谢

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3楼2016-03-06 17:56:08
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jackyoung

新虫 (正式写手)
谁用谁知道，用这个系列的载体那个效率还是有点儿低，后来就果断换了拓扑异构酶连接载体了。

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CestLaVie
4楼2016-03-06 18:22:16
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原海亮

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
零星风前絮: 金币+10, ★★★★★最佳答案 2016-03-06 22:10:03
这个连接还是要看个人习惯和实验安排的，我们用过22连接一到两个小时的，照样可以达到实验需要，这和具体实验有关。克隆做多了，熟练了，就不会纠结这么些细节了，时间紧就缩短点时间，安排不过来就放过夜，大部分人选择过夜主要是用一些T4连接酶保留的习惯，到T载也懒得改，对实验影响也不大。

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天空才是极限，我有信心飞的更高！
5楼2016-03-06 19:42:41
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零星风前絮

银虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 原海亮 at 2016-03-06 19:42:41
这个连接还是要看个人习惯和实验安排的，我们用过22连接一到两个小时的，照样可以达到实验需要，这和具体实验有关。克隆做多了，熟练了，就不会纠结这么些细节了，时间紧就缩短点时间，安排不过来就放过夜，大部分人 ...

好的，谢谢~！
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6楼2016-03-06 22:09:36
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ddt123456789

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
1楼: Originally posted by 零星风前絮 at 2016-03-06 16:21:17
在实验室实习，看到takara公司的pmd19T载体说明书上说16℃连接三十分钟，而实验室的师兄师姐都是过夜连接？差别大么？如果时间比较赶该怎么做？谢谢各位！

公司为了能把产品卖出去，肯定不会给一份错误的protocol，所以可以大胆地按照protocol来，根据本科实习的经验来看，过夜对效率的提升并不明显。因为Taq保真度的问题，现在都改用高保真酶，所以基本上T载体就用不着了

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7楼2016-03-07 00:07:43
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