24小时热门版块排行榜    

查看: 3542  |  回复: 24

yeruge

新虫 (小有名气)


已领完
去磷酸化酶
领取红包 (小木虫手机app专属红包)

扫一扫,下载小木虫客户端

对载体进行双酶切,需要去磷酸化吗?如果要,去磷酸化酶是在酶切反应之后加,还是酶切片段割胶纯化后再加?

发自小木虫Android客户端
回复此楼

» 猜你喜欢

» 抢金币啦!回帖就可以得到:

查看全部散金贴

已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

longwave

木虫之王 (文学泰斗)


12楼2016-03-03 18:55:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

原海亮

木虫 (著名写手)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
双酶切是否需要去磷酸化,取决于你构建克隆的目的,如果一般克隆的话,只要保证酶切充分些,获得正确克隆概率还是可以的,如果构建文库之类的,最好有去磷酸化处理,保证文库中克隆的连接效率。去磷酸化我们同常在回收获得载体片段后再进行的。PS.虽然我进来已经没有金币了

发自小木虫Android客户端

» 本帖已获得的红花(最新10朵)

13楼2016-03-03 19:01:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lifechuteng

新虫 (小有名气)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
双酶切不需要去磷酸化的,因为两个酶切位点粘性末端应该不同,在酶切完全的前提下,不会发生载体自连。
并且,载体去磷酸化之后,会影响后续的连接效率。
最后,鄙视那些只领红包不帮忙的人……

» 本帖已获得的红花(最新10朵)

14楼2016-03-03 19:02:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yeruge

新虫 (小有名气)


送红花一朵
引用回帖:
13楼: Originally posted by 原海亮 at 2016-03-03 19:01:39
双酶切是否需要去磷酸化,取决于你构建克隆的目的,如果一般克隆的话,只要保证酶切充分些,获得正确克隆概率还是可以的,如果构建文库之类的,最好有去磷酸化处理,保证文库中克隆的连接效率。去磷酸化我们同常在回 ...

我做的是原核表达,不知道需不需要去磷酸化?还有,得到载体片段去磷酸化后还需要纯化么?

发自小木虫Android客户端
15楼2016-03-03 19:04:52
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yeruge

新虫 (小有名气)


送红花一朵
引用回帖:
14楼: Originally posted by lifechuteng at 2016-03-03 19:02:31
双酶切不需要去磷酸化的,因为两个酶切位点粘性末端应该不同,在酶切完全的前提下,不会发生载体自连。
并且,载体去磷酸化之后,会影响后续的连接效率。
最后,鄙视那些只领红包不帮忙的人……

谢谢,我就是一直连接不上

发自小木虫Android客户端
16楼2016-03-03 19:06:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lifechuteng

新虫 (小有名气)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
16楼: Originally posted by yeruge at 2016-03-03 19:06:00
谢谢,我就是一直连接不上
...

不需要去磷酸化,因为连接中要用到载体上的磷酸基团,你去掉之后,引物上的羟基就无法连到磷酸基团上啦~
用普通的引物进行PCR ,产物的5‘端和3’端都是羟基的,载体切开后的磷酸基团是它们连接的唯一希望……

但最好双酶切后跑电泳胶回收一下,将载体上切下的小片段分离出去~
17楼2016-03-03 19:11:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

原海亮

木虫 (著名写手)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
15楼: Originally posted by yeruge at 2016-03-03 19:04:52
我做的是原核表达,不知道需不需要去磷酸化?还有,得到载体片段去磷酸化后还需要纯化么?
...

我们现在普通克隆(双酶切)一般不会进行磷酸化处理,去磷酸化后可以直接过柱纯化。不清楚你插入片段的来源,一般PCR产物酶切还是需要适当加大酶量和延长酶切时间的,载体也一样,这样的连接获得正确克隆应该问题不大。

发自小木虫Android客户端
18楼2016-03-03 19:13:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yeruge

新虫 (小有名气)


引用回帖:
17楼: Originally posted by lifechuteng at 2016-03-03 19:11:56
不需要去磷酸化,因为连接中要用到载体上的磷酸基团,你去掉之后,引物上的羟基就无法连到磷酸基团上啦~
用普通的引物进行PCR ,产物的5‘端和3’端都是羟基的,载体切开后的磷酸基团是它们连接的唯一希望……

...

takara的内切酶一般反应多久?

发自小木虫Android客户端
19楼2016-03-03 19:14:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lifechuteng

新虫 (小有名气)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
19楼: Originally posted by yeruge at 2016-03-03 19:14:22
takara的内切酶一般反应多久?
...

这个要看是不是快切酶了,不是的话,我一般切三个小时。不知你的DNA片段是怎么切的

发自小木虫Android客户端
20楼2016-03-03 19:16:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yeruge

新虫 (小有名气)


引用回帖:
20楼: Originally posted by lifechuteng at 2016-03-03 19:16:50
这个要看是不是快切酶了,不是的话,我一般切三个小时。不知你的DNA片段是怎么切的
...

现在是构建重组表达载体,对克隆后提取的质粒和表达载体pet28a进行酶切

发自小木虫Android客户端
21楼2016-03-03 19:19:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

原海亮

木虫 (著名写手)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
17楼: Originally posted by lifechuteng at 2016-03-03 19:11:56
不需要去磷酸化,因为连接中要用到载体上的磷酸基团,你去掉之后,引物上的羟基就无法连到磷酸基团上啦~
用普通的引物进行PCR ,产物的5‘端和3’端都是羟基的,载体切开后的磷酸基团是它们连接的唯一希望……

...

首先对于高质量的连接效率,对载体进行去磷酸化是需要的(双酶切处理好了,影响不大,但是为了避免双酶切体系一些载体酶切不完全,仍处于单酶切的形态,接下来同样会可能自连出现空载。如果是单酶切,按照常规操作,去磷酸化是必须的!),这样子虽然载体5端没有磷酸基团,但是连接时候是用的片段的5端磷酸基团,尽管PCR产物末端为羟基,但是这样的PCR产物是不能直接用于连接的,它需要用同样的酶来进行处理,这样就暴露了粘性末端或者平末端的5端磷酸基团,当然而这样连接后必然会在双链留下两个缺口,后续转化进去感受态细胞中会被修复。

发自小木虫Android客户端
22楼2016-03-03 19:44:19
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yeruge

新虫 (小有名气)


引用回帖:
22楼: Originally posted by 原海亮 at 2016-03-03 19:44:19
首先对于高质量的连接效率,对载体进行去磷酸化是需要的(双酶切处理好了,影响不大,但是为了避免双酶切体系一些载体酶切不完全,仍处于单酶切的形态,接下来同样会可能自连出现空载。如果是单酶切,按照常规操作 ...

我要跑电泳割胶回收的,就算载体自连,应该也没事吧?我双酶切三小时

发自小木虫Android客户端
23楼2016-03-03 20:30:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

原海亮

木虫 (著名写手)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
23楼: Originally posted by yeruge at 2016-03-03 20:30:13
我要跑电泳割胶回收的,就算载体自连,应该也没事吧?我双酶切三小时
...

我的意思是,双酶切不进行磷酸化,一般是可以满足你的实验要求的!当然你这里说的切胶回收,和能不能避免自连是没有关系的,打个比方即使你切胶回收,如果酶切不完全,回收的片段里同样会有双酶切的载体和单酶切的载体,因为他们两个在电泳上大小是一样的,无法分开(除非你之前载体酶切位点中间包含一个片段),而载体自连,主要发生在你后续的连接体系中,所以这也是为什么有些实验在连接前需要磷酸化的原因。

发自小木虫Android客户端
24楼2016-03-03 21:26:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yeruge

新虫 (小有名气)


引用回帖:
24楼: Originally posted by 原海亮 at 2016-03-03 21:26:13
我的意思是,双酶切不进行磷酸化,一般是可以满足你的实验要求的!当然你这里说的切胶回收,和能不能避免自连是没有关系的,打个比方即使你切胶回收,如果酶切不完全,回收的片段里同样会有双酶切的载体和单酶切的 ...

后续实验载体自连,就会出现假阳性?

发自小木虫Android客户端
25楼2016-03-03 22:56:26
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
简单回复
rnydufe2楼
2016-03-03 18:55   回复  
yeruge(金币+1): 谢谢参与
已获得1个金币 发自小木虫IOS客户端
2016-03-03 18:55   回复  
yeruge(金币+6): 谢谢参与
已获得6个金币 发自小木虫Android客户端
beverish4楼
2016-03-03 18:55   回复  
yeruge(金币+2): 谢谢参与
已获得2个金币 发自小木虫Android客户端
wht123zzy5楼
2016-03-03 18:55   回复  
yeruge(金币+10): 谢谢参与
已获得10个金币 发自小木虫Android客户端
2016-03-03 18:55   回复  
yeruge(金币+7): 谢谢参与
已获得7个金币 发自小木虫Android客户端
longwave7楼
2016-03-03 18:55   回复  
yeruge(金币+9): 谢谢参与
已获得9个金币 发自小木虫Android客户端
2016-03-03 18:55   回复  
yeruge(金币+3): 谢谢参与
已获得3个金币 发自小木虫Android客户端
2016-03-03 18:55   回复  
yeruge(金币+8): 谢谢参与
已获得8个金币 发自小木虫Android客户端
sdp_sqf10楼
2016-03-03 18:55   回复  
yeruge(金币+4): 谢谢参与
已获得4个金币 发自小木虫Android客户端
zbwlll11楼
2016-03-03 18:55   回复  
相关版块跳转 我要订阅楼主 yeruge 的主题更新
普通表情 高级回复 (可上传附件)
信息提示
请填处理意见