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yeruge

新虫 (小有名气)
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去磷酸化酶
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对载体进行双酶切，需要去磷酸化吗？如果要，去磷酸化酶是在酶切反应之后加，还是酶切片段割胶纯化后再加？

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1楼 2016-03-03 18:55:18
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longwave

木虫之王 (文学泰斗)
谢谢

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12楼2016-03-03 18:55:49
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原海亮

木虫 (著名写手)
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双酶切是否需要去磷酸化，取决于你构建克隆的目的，如果一般克隆的话，只要保证酶切充分些，获得正确克隆概率还是可以的，如果构建文库之类的，最好有去磷酸化处理，保证文库中克隆的连接效率。去磷酸化我们同常在回收获得载体片段后再进行的。PS.虽然我进来已经没有金币了

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yeruge
13楼2016-03-03 19:01:39
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lifechuteng

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
双酶切不需要去磷酸化的，因为两个酶切位点粘性末端应该不同，在酶切完全的前提下，不会发生载体自连。
并且，载体去磷酸化之后，会影响后续的连接效率。
最后，鄙视那些只领红包不帮忙的人……
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yeruge
14楼2016-03-03 19:02:31
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yeruge

新虫 (小有名气)
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13楼: Originally posted by 原海亮 at 2016-03-03 19:01:39
双酶切是否需要去磷酸化，取决于你构建克隆的目的，如果一般克隆的话，只要保证酶切充分些，获得正确克隆概率还是可以的，如果构建文库之类的，最好有去磷酸化处理，保证文库中克隆的连接效率。去磷酸化我们同常在回 ...

我做的是原核表达，不知道需不需要去磷酸化？还有，得到载体片段去磷酸化后还需要纯化么？

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15楼2016-03-03 19:04:52
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yeruge

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14楼: Originally posted by lifechuteng at 2016-03-03 19:02:31
双酶切不需要去磷酸化的，因为两个酶切位点粘性末端应该不同，在酶切完全的前提下，不会发生载体自连。
并且，载体去磷酸化之后，会影响后续的连接效率。
最后，鄙视那些只领红包不帮忙的人……

谢谢，我就是一直连接不上

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16楼2016-03-03 19:06:00
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lifechuteng

新虫 (小有名气)
★
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16楼: Originally posted by yeruge at 2016-03-03 19:06:00
谢谢，我就是一直连接不上
...

不需要去磷酸化，因为连接中要用到载体上的磷酸基团，你去掉之后，引物上的羟基就无法连到磷酸基团上啦~
用普通的引物进行PCR ,产物的5‘端和3’端都是羟基的，载体切开后的磷酸基团是它们连接的唯一希望……

但最好双酶切后跑电泳胶回收一下，将载体上切下的小片段分离出去~
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17楼2016-03-03 19:11:56
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原海亮

木虫 (著名写手)
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15楼: Originally posted by yeruge at 2016-03-03 19:04:52
我做的是原核表达，不知道需不需要去磷酸化？还有，得到载体片段去磷酸化后还需要纯化么？
...

我们现在普通克隆（双酶切）一般不会进行磷酸化处理，去磷酸化后可以直接过柱纯化。不清楚你插入片段的来源，一般PCR产物酶切还是需要适当加大酶量和延长酶切时间的，载体也一样，这样的连接获得正确克隆应该问题不大。

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18楼2016-03-03 19:13:40
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yeruge

新虫 (小有名气)
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17楼: Originally posted by lifechuteng at 2016-03-03 19:11:56
不需要去磷酸化，因为连接中要用到载体上的磷酸基团，你去掉之后，引物上的羟基就无法连到磷酸基团上啦~
用普通的引物进行PCR ,产物的5‘端和3’端都是羟基的，载体切开后的磷酸基团是它们连接的唯一希望……

...

takara的内切酶一般反应多久？

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19楼2016-03-03 19:14:22
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lifechuteng

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19楼: Originally posted by yeruge at 2016-03-03 19:14:22
takara的内切酶一般反应多久？
...

这个要看是不是快切酶了，不是的话，我一般切三个小时。不知你的DNA片段是怎么切的

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20楼2016-03-03 19:16:50
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yeruge

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20楼: Originally posted by lifechuteng at 2016-03-03 19:16:50
这个要看是不是快切酶了，不是的话，我一般切三个小时。不知你的DNA片段是怎么切的
...

现在是构建重组表达载体，对克隆后提取的质粒和表达载体pet28a进行酶切

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21楼2016-03-03 19:19:35
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原海亮

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17楼: Originally posted by lifechuteng at 2016-03-03 19:11:56
不需要去磷酸化，因为连接中要用到载体上的磷酸基团，你去掉之后，引物上的羟基就无法连到磷酸基团上啦~
用普通的引物进行PCR ,产物的5‘端和3’端都是羟基的，载体切开后的磷酸基团是它们连接的唯一希望……

...

首先对于高质量的连接效率，对载体进行去磷酸化是需要的（双酶切处理好了，影响不大，但是为了避免双酶切体系一些载体酶切不完全，仍处于单酶切的形态，接下来同样会可能自连出现空载。如果是单酶切，按照常规操作，去磷酸化是必须的！），这样子虽然载体5端没有磷酸基团，但是连接时候是用的片段的5端磷酸基团，尽管PCR产物末端为羟基，但是这样的PCR产物是不能直接用于连接的，它需要用同样的酶来进行处理，这样就暴露了粘性末端或者平末端的5端磷酸基团，当然而这样连接后必然会在双链留下两个缺口，后续转化进去感受态细胞中会被修复。

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22楼2016-03-03 19:44:19
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yeruge

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22楼: Originally posted by 原海亮 at 2016-03-03 19:44:19
首先对于高质量的连接效率，对载体进行去磷酸化是需要的（双酶切处理好了，影响不大，但是为了避免双酶切体系一些载体酶切不完全，仍处于单酶切的形态，接下来同样会可能自连出现空载。如果是单酶切，按照常规操作 ...

我要跑电泳割胶回收的，就算载体自连，应该也没事吧？我双酶切三小时

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23楼2016-03-03 20:30:13
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原海亮

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23楼: Originally posted by yeruge at 2016-03-03 20:30:13
我要跑电泳割胶回收的，就算载体自连，应该也没事吧？我双酶切三小时
...

我的意思是，双酶切不进行磷酸化，一般是可以满足你的实验要求的！当然你这里说的切胶回收，和能不能避免自连是没有关系的，打个比方即使你切胶回收，如果酶切不完全，回收的片段里同样会有双酶切的载体和单酶切的载体，因为他们两个在电泳上大小是一样的，无法分开（除非你之前载体酶切位点中间包含一个片段），而载体自连，主要发生在你后续的连接体系中，所以这也是为什么有些实验在连接前需要磷酸化的原因。

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24楼2016-03-03 21:26:13
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yeruge

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24楼: Originally posted by 原海亮 at 2016-03-03 21:26:13
我的意思是，双酶切不进行磷酸化，一般是可以满足你的实验要求的！当然你这里说的切胶回收，和能不能避免自连是没有关系的，打个比方即使你切胶回收，如果酶切不完全，回收的片段里同样会有双酶切的载体和单酶切的 ...

后续实验载体自连，就会出现假阳性？

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25楼2016-03-03 22:56:26
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rnydufe2楼
2016-03-03 18:55   回复  
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11766639833楼
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beverish4楼
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sdp_sqf10楼
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