13楼: Originally posted by 原海亮 at 2016-03-03 19:01:39
双酶切是否需要去磷酸化，取决于你构建克隆的目的，如果一般克隆的话，只要保证酶切充分些，获得正确克隆概率还是可以的，如果构建文库之类的，最好有去磷酸化处理，保证文库中克隆的连接效率。去磷酸化我们同常在回 ...

14楼: Originally posted by lifechuteng at 2016-03-03 19:02:31
双酶切不需要去磷酸化的，因为两个酶切位点粘性末端应该不同，在酶切完全的前提下，不会发生载体自连。
并且，载体去磷酸化之后，会影响后续的连接效率。
最后，鄙视那些只领红包不帮忙的人……

16楼: Originally posted by yeruge at 2016-03-03 19:06:00
谢谢，我就是一直连接不上
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15楼: Originally posted by yeruge at 2016-03-03 19:04:52
我做的是原核表达，不知道需不需要去磷酸化？还有，得到载体片段去磷酸化后还需要纯化么？
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17楼: Originally posted by lifechuteng at 2016-03-03 19:11:56
不需要去磷酸化，因为连接中要用到载体上的磷酸基团，你去掉之后，引物上的羟基就无法连到磷酸基团上啦~
用普通的引物进行PCR ,产物的5‘端和3’端都是羟基的，载体切开后的磷酸基团是它们连接的唯一希望……

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19楼: Originally posted by yeruge at 2016-03-03 19:14:22
takara的内切酶一般反应多久？
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20楼: Originally posted by lifechuteng at 2016-03-03 19:16:50
这个要看是不是快切酶了，不是的话，我一般切三个小时。不知你的DNA片段是怎么切的
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17楼: Originally posted by lifechuteng at 2016-03-03 19:11:56
不需要去磷酸化，因为连接中要用到载体上的磷酸基团，你去掉之后，引物上的羟基就无法连到磷酸基团上啦~
用普通的引物进行PCR ,产物的5‘端和3’端都是羟基的，载体切开后的磷酸基团是它们连接的唯一希望……

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22楼: Originally posted by 原海亮 at 2016-03-03 19:44:19
首先对于高质量的连接效率，对载体进行去磷酸化是需要的（双酶切处理好了，影响不大，但是为了避免双酶切体系一些载体酶切不完全，仍处于单酶切的形态，接下来同样会可能自连出现空载。如果是单酶切，按照常规操作 ...

23楼: Originally posted by yeruge at 2016-03-03 20:30:13
我要跑电泳割胶回收的，就算载体自连，应该也没事吧？我双酶切三小时
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24楼: Originally posted by 原海亮 at 2016-03-03 21:26:13
我的意思是，双酶切不进行磷酸化，一般是可以满足你的实验要求的！当然你这里说的切胶回收，和能不能避免自连是没有关系的，打个比方即使你切胶回收，如果酶切不完全，回收的片段里同样会有双酶切的载体和单酶切的 ...