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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸提取 » 去磷酸化酶
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yeruge

新虫 (小有名气)
已领完
去磷酸化酶
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对载体进行双酶切，需要去磷酸化吗？如果要，去磷酸化酶是在酶切反应之后加，还是酶切片段割胶纯化后再加？

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1楼 2016-03-03 18:55:18
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原海亮

木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
23楼: Originally posted by yeruge at 2016-03-03 20:30:13
我要跑电泳割胶回收的，就算载体自连，应该也没事吧？我双酶切三小时
...

我的意思是，双酶切不进行磷酸化，一般是可以满足你的实验要求的！当然你这里说的切胶回收，和能不能避免自连是没有关系的，打个比方即使你切胶回收，如果酶切不完全，回收的片段里同样会有双酶切的载体和单酶切的载体，因为他们两个在电泳上大小是一样的，无法分开（除非你之前载体酶切位点中间包含一个片段），而载体自连，主要发生在你后续的连接体系中，所以这也是为什么有些实验在连接前需要磷酸化的原因。

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24楼2016-03-03 21:26:13
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longwave

木虫之王 (文学泰斗)
谢谢

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12楼2016-03-03 18:55:49
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原海亮

木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
双酶切是否需要去磷酸化，取决于你构建克隆的目的，如果一般克隆的话，只要保证酶切充分些，获得正确克隆概率还是可以的，如果构建文库之类的，最好有去磷酸化处理，保证文库中克隆的连接效率。去磷酸化我们同常在回收获得载体片段后再进行的。PS.虽然我进来已经没有金币了

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yeruge
13楼2016-03-03 19:01:39
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lifechuteng

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
双酶切不需要去磷酸化的，因为两个酶切位点粘性末端应该不同，在酶切完全的前提下，不会发生载体自连。
并且，载体去磷酸化之后，会影响后续的连接效率。
最后，鄙视那些只领红包不帮忙的人……
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yeruge
14楼2016-03-03 19:02:31
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rnydufe2楼
2016-03-03 18:55   回复  
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11766639833楼
2016-03-03 18:55   回复  
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beverish4楼
2016-03-03 18:55   回复  
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wht123zzy5楼
2016-03-03 18:55   回复  
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187659257766楼
2016-03-03 18:55   回复  
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longwave7楼
2016-03-03 18:55   回复  
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W菜鸟驿站T8楼
2016-03-03 18:55   回复  
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金黄球菌t9楼
2016-03-03 18:55   回复  
yeruge(金币+8): 谢谢参与
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sdp_sqf10楼
2016-03-03 18:55   回复  
yeruge(金币+4): 谢谢参与
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zbwlll11楼
2016-03-03 18:55   回复  
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